新型芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用研究進(jìn)展

袁海峰 ，周舒揚(yáng) ，甄 濤 ，趙曉宇 ，3*

（1.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所；3.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院）

生物防治是一種綠色高效且相對(duì)安全的防治措施，契合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求，近年來逐漸受到重視。芽孢桿菌產(chǎn)生抗逆性極強(qiáng)的芽孢，對(duì)生態(tài)環(huán)境無污染，可以與環(huán)境中的其他微生物互作，具有廣譜的抑菌活性，誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性，孢桿菌包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、膠凍芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短短芽孢桿菌。

1 貝萊斯芽孢桿菌

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是近年來篩選獲得的新型生防菌株，由Cristina等在西班牙南部馬赫拉加分離得到命名為貝萊斯芽孢桿菌。早期認(rèn)為是枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種，直到2008年被確定為解淀粉芽孢桿菌的后期異型體。近些年對(duì)貝萊斯芽孢桿菌的報(bào)道越來越多，具有廣譜的抑菌活性，并表現(xiàn)出促進(jìn)植物生長的作用機(jī)制，在農(nóng)業(yè)種植領(lǐng)域具有廣泛開發(fā)潛力。

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)曾慶超同寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所沙月霞等[1]，在寧夏水稻葉片中分離獲得一株菌株定名為E69，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。貝萊斯芽孢桿菌E69發(fā)酵上清液對(duì)稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）的拮抗作用，并測(cè)試兩株內(nèi)生芽孢桿菌對(duì)立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）、鐮孢菌（Fusarium spp.）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、草莓炭疽病菌（Colletotrichum gloeospoioides）、 煙 草 黑 脛 病 菌 （Phytophthora parasiticav ar.nicotianae）、鏈格孢菌（Alternaria alternate）、西瓜枯萎病菌（F.oxysporum）等11種植物病原菌的拮抗作用，對(duì)多種植物病原真菌的拮抗作用，尤其是對(duì)稻瘟病的生物防治效果。菌株E69對(duì)稻瘟病菌菌絲生長具有顯著拮抗作用，溫室條件下兩個(gè)菌株對(duì)稻瘟病的預(yù)防效果分別為83.24%和76.57%，對(duì)葉瘟的田間預(yù)防效果分別為85.97%和79.76%，對(duì)穗頸瘟的田間預(yù)防效果分別為69.67%和68.82%，E69對(duì)葉瘟的預(yù)防效果顯著高于75%的三環(huán)唑可濕性粉劑，對(duì)穗頸瘟的預(yù)防效果與化學(xué)藥劑無顯著差異。菌株E69對(duì)立枯絲核菌、鐮孢菌、番茄灰霉病菌、草莓炭疽病菌、煙草黑脛病菌、葉枯病菌、西瓜枯萎病菌等11種植物病原菌有顯著拮抗作用，E69的拮抗作用明顯高于枯草芽孢桿菌E66。菌株E69能夠抑制稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)和附著胞的形成，E69發(fā)酵液的抑菌效果分別為95.28%和94.16%，無菌上清液的抑菌效果分別為85.36%和84.31%；E66發(fā)酵液對(duì)分生孢子萌發(fā)和附著胞形成的抑菌效果分別為89.15%和87.38%，無菌上清液的抑菌效果分別為79.65%和72.45%。可見，貝萊斯芽孢桿菌菌株E69是一種潛在的、預(yù)防效果明顯的生防菌株，具有預(yù)防稻瘟病兼防紋枯病等多種真菌病害的應(yīng)用潛力。

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院陶永梅等[2]，以水稻條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola，Xoc）的模式菌株RS105為靶標(biāo)菌，采用平板稀釋和抑菌圈法，從空心菜根際土壤中篩選到一株對(duì)RS105具有拮抗作用的細(xì)菌菌株504。通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征以及16SrDNA和gyrA序列分析對(duì)菌株504進(jìn)行了鑒定，為貝萊斯芽孢桿菌，命名為Bacillusvelezensis504。抑菌實(shí)驗(yàn)顯示，B.velezensis504對(duì)黃單胞菌屬的細(xì)菌具有較好的抑菌活性，對(duì)水稻白葉枯病菌（X.oryzaepv.oryzae,Xoo）的拮抗效果最顯著?；蝾A(yù)測(cè)結(jié)果顯示，B.velezensis 504含有 fenA、dhbA、sfrA、bmyA、beaS、dfnA 及 bacA 等編碼脂肽類和聚酮糖類抑菌化合物的基因簇。在高感水稻品種原豐早上，B.velezensis 504對(duì)Xoc在水稻葉片中引起的水漬癥狀具有顯著的抑制作用。

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉雪嬌等[3]，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）3A3-15生防和促生作用相關(guān)機(jī)理，采用9對(duì)特異性引物對(duì)其抑菌基因和促生長基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，并分別通過Sackowski法、Schwyn和Neiland法檢測(cè)其分泌吲哚乙酸（IAA）和嗜鐵素能力，通過高效液相色譜—電噴霧質(zhì)譜（HPLC-ESI-MS）分析其發(fā)酵液抑菌成分，采用平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)和孢子萌發(fā)抑制實(shí)驗(yàn)分析該菌株的抑菌機(jī)理。結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌3A3-15中的抑菌基因包括 yndJ、srfAB、ituC、bamC 和 fenD，促生長基因包括ysnE和dhbC。該菌株分泌嗜鐵素能力較強(qiáng)，鑒定其抑菌物質(zhì)為C14～C15 surfactinA，且貝萊斯芽孢桿菌3A3-15的次生代謝物能導(dǎo)致病原菌（尖孢鐮刀菌）菌絲扭曲、膨大、畸形，對(duì)其孢子萌發(fā)抑制作用較強(qiáng)，抑制率達(dá)93.2%。以上結(jié)果說明貝萊斯芽孢桿菌3A3-15具有較好的生防和促生潛力，是防治尖孢鐮刀菌引起的大豆根腐病的潛在菌株。

2 多黏芽孢桿菌

多黏類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa）作為生防菌的一個(gè)重要組分，對(duì)小麥赤霉病、番茄青枯病、木麻黃青枯病等多種植物病害均有一定的防治效果。多黏類芽孢桿菌對(duì)植物具有非致病性，且細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，對(duì)人畜無害，在產(chǎn)品開發(fā)中活菌數(shù)量高、性能穩(wěn)定，是一種理想的生防菌。

李歡[4]等從連云港海域海泥中分離得到1株多黏類芽孢桿菌L1-9菌株，該菌株對(duì)多種植物病原真菌和細(xì)菌有較好的抑制作用，并且能夠產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶和纖維素酶等細(xì)胞壁水解酶和抗菌蛋白，具有一定的開發(fā)潛力。李歡等采用含藥平板法測(cè)定L1-9菌株粉劑對(duì)黃瓜枯萎病菌、大豆菌核病菌、水稻紋枯病菌及菠菜早疫病菌4種植物病原真菌的毒力，建立毒力回歸方程，進(jìn)而采用盆栽試驗(yàn)測(cè)定了拌種、拌土及灌根3種用藥方法對(duì)黃瓜的促生效果及對(duì)黃瓜枯萎病的防治作用，為海洋多黏類芽孢桿菌菌劑的研究提供參考依據(jù)。結(jié)果表明：L1-9菌株粉劑對(duì)菠菜早疫病菌的抑制作用最強(qiáng)，半數(shù)有效質(zhì)量濃度（EC50） 和 90%有效質(zhì)量濃度（EC90） 分別為38.3122mg/L和66.7322mg/L；其對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制作用次之，EC50和EC90分別為 48.9252mg/L和86.7132mg/L。L1-9菌株粉劑3種用藥方式均對(duì)黃瓜的生長發(fā)育產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用，拌土用藥后黃瓜地上部分鮮質(zhì)量增加了243.75%，拌種用藥后黃瓜須根數(shù)增加了113.11%。L1-9菌株粉劑對(duì)黃瓜枯萎病有較強(qiáng)的防治效果，拌種、拌土和灌根3種用藥方式的防治效果分別為77.12%、81.32%、78.75%。綜上，L1-9菌株粉劑對(duì)4種植物病原真菌均具有明顯的抑菌作用，且對(duì)黃瓜具有明顯的促生防病作用。

河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院曹麗亞[5]等，研究了多黏類芽孢桿菌HT16對(duì)梨黑斑病菌（Alternaria kikuchiana）的抑制作用，并對(duì)其應(yīng)用效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，多黏類芽孢桿菌HT16對(duì)梨黑斑病菌的體外抑制率為53.2%，其粗提蛋白嚴(yán)重破壞了梨黑斑病菌的菌絲和孢子，顯著抑制了梨采后黑斑病的發(fā)生，呈現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力。

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院申順善[6]等從健康的化香（PlatycaryastrobilaceaSieb.et Zucc.）根際土壤中分離獲得生防菌HK18-8，通過對(duì)峙培養(yǎng)和孢子萌發(fā)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株HK18-8可顯著抑制辣椒炭疽病病原菌短尖刺盤孢（Collectotrichumacutatum）的菌絲生長和分生孢子萌發(fā)，其抑菌帶達(dá)到10mm，孢子萌發(fā)抑制率為70.15%；進(jìn)行離體辣椒果實(shí)接種試驗(yàn)表明，HK18-8菌懸液對(duì)辣椒炭疽病的防治效果達(dá)到88.58%，其預(yù)防效果高于治療效果，HK18-8的發(fā)酵液和菌懸液的防病效果顯著；采用平板稀釋法測(cè)定其在辣椒果實(shí)的定殖能力，處理9d時(shí)仍能保持106cfu·g-1以上；根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性及16SrRNA序列同源性，HK18-8菌株鑒定為多粘類芽孢桿菌。

3 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillusmethylotrophicus）是MunusamyMadhaiyan等人2010年報(bào)道的新種，作為芽孢桿菌屬的一員，其生防功能逐漸被科研工作者揭示。

采俊香[7]等對(duì)抱莖苦荬菜內(nèi)生甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌G-5抗菌蛋白抗真菌特性進(jìn)行研究，其對(duì)番茄早疫病病菌、梨黑斑病病菌和番茄灰霉病病菌均具有較好抑菌效果，抑菌率分別為88.3%、90.5%和95.4%；王洪梅[8]等從土壤中篩選出一株對(duì)番茄青枯病病原菌具有較強(qiáng)抑制效果的菌株N5，經(jīng)鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，通過理化分析實(shí)驗(yàn)證明其起到抑菌效果的代謝產(chǎn)物為鐵載體、β-葡聚糖酶、纖維素酶、蛋白酶及多種脂肽類物質(zhì)。呂倩[9]等從南海深海海泥中采集的88個(gè)細(xì)菌樣品中分離出一株具有較強(qiáng)抗真菌活性的細(xì)菌SHB114，鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，其對(duì)黃瓜炭疽病菌、立枯絲核菌、黃瓜枯萎病菌等植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制活性。對(duì)其抗真菌活性物質(zhì)跟蹤檢測(cè)，分離純化得到3個(gè)脂肽類化合物，經(jīng)鑒定均為bacillomycinLc類脂肽。

4 暹羅芽孢桿菌

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所王瑤[10]等，采用平板對(duì)峙法測(cè)定從藍(lán)莓根圍土壤中分離的純化菌株對(duì)藍(lán)莓根腐病原菌尖孢鐮刀菌（Fusariunoxysporun）的抑菌活性。篩選出10株有拮抗作用的細(xì)菌；B6、B7、B9菌株對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率依次為83.89%、82.44%、79.39%；選擇抑菌率較高的B6、B7、B10菌株在溫室內(nèi)盆栽藍(lán)莓幼苗上測(cè)定其抑菌作用，B6菌株抑菌效果最好，發(fā)病率僅為13.3%；結(jié)合形態(tài)特征和16SrDNA序列分析進(jìn)行拮抗細(xì)菌的鑒定，10株拮抗細(xì)菌均屬于芽孢桿菌屬。B2、B10為解淀粉芽孢桿菌，B3為解淀粉芽孢桿菌亞種，B4為枯草芽孢桿菌，B5、B6為暹羅芽孢桿菌。

長江大學(xué)夏雨晨[11]等從小麥內(nèi)生菌中篩選出小麥赤霉病拮抗菌，試驗(yàn)采用平板對(duì)峙法從小麥根、莖、葉、穗中篩選對(duì)小麥赤霉菌具有高效拮抗作用的內(nèi)生菌株。共得到7株小麥赤霉菌拮抗菌，其中從小麥葉部分離到的WY-3表現(xiàn)最強(qiáng)的拮抗能力，抑菌圈直徑達(dá)到26.3mm。通過生理生化特征以及16SrDNA序列分析，初步鑒定WY-3為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）。WY-3對(duì)火龍果炭疽病菌（Colletotrichumgloeosporioides）、棉花立枯病菌（Rhizoctoniasolani）、白絹病菌（Sclerotium rolfsii）、梨黑斑病菌（Alternariakikuchiana）也表現(xiàn)較好的拮抗活性。

5 展望

目前，隨著綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展和重視，生物農(nóng)藥及肥料市場(chǎng)需求與日俱增。與此同時(shí)，芽孢桿菌其環(huán)境友好的特點(diǎn)被市場(chǎng)認(rèn)可。隨著科技的發(fā)展，更多的新菌種被發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證其生物學(xué)功能，同時(shí)隨著分子進(jìn)化、分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展，新種也逐漸被命名，豐富了芽孢桿菌的種類。