張學(xué)學(xué)， 趙東曉， 李建橋， 盧順光， 胡建忠， 李曼姝， 劉朝霞， 鄒 坤

(1.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 宜昌 443002；2.水利部水土保持植物開發(fā)管理中心， 北京 100038)

小花清風(fēng)藤SabiaparvifloraWall. ex Roxb為清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬植物，生境分布主要集中在我國廣西、云南、貴州等地，為苗族、布依族的民間用藥，在民間有“黃腫藥”、“小黃藥”、“黃眼藥”等俗稱[1-3].因其具有清熱利濕、止血的作用，故主要用于治療濕熱黃疸、肝炎、止血等[4-7].根據(jù)文獻(xiàn)報道，小花清風(fēng)藤含多種潛在活性化學(xué)成分，主要包括生物堿類、五環(huán)三萜類、黃酮類及苯丙素類等[8-11].本課題組此前研究表明小花清風(fēng)藤莖葉自然混合的不同溶劑提取物對急性酒精性肝損傷小鼠及CCL4致小鼠急性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，且其作用機(jī)制可能與其抗氧化作用有關(guān)[12-13]，同時，小花清風(fēng)藤莖葉的石油醚萃取部位分離所獲24-羥基-3-氧代-12-齊墩果烯-28-酸，β-谷甾醇，豆甾醇和齊墩果酸4種化合物，均具有顯著的肝保護(hù)作用[14].劉易蓉、邱曉春等研究也表明小花清風(fēng)藤提取物對2種肝損傷模型小鼠血清AST、ALT的活性有一定降低作，具有一定的肝保護(hù)作用[4].此外，本課題組還對小花清風(fēng)藤中含有的微量元素及揮發(fā)油成分進(jìn)行了研究[15-16]，但目前小花清風(fēng)藤水提物的提取工藝尚不明確.為進(jìn)一步開發(fā)這一藥用資源，本研究以CCl4損傷后的LO2細(xì)胞活性為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法研究其提取工藝.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器有限公司)；500 mL錐形瓶(天津天玻玻璃儀器有限公司)；電子分析天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；渦旋振蕩器(美國奧然科技有限公司)；高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；超凈工作臺(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；臺式高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；Tecan多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN集團(tuán)公司).

1.1.2 試劑 本研究使用了CCl4、胰蛋白酶溶液(稱取0.25 g胰蛋白酶，加入80 mL×PBS緩沖液，完全溶解后，定容至100 mL，過濾除菌，4℃保存)；1640培養(yǎng)基(將1640粉末溶于800 mL去離子水，再加入NaHCO3定容至1.0 L，0.22 μm過濾滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆?；小牛血清；二甲基噻唑二苯基四唑嗅鹽(20.0 mg 二甲基噻唑二苯基四唑嗅鹽溶于4.0 mL的PBS，充分溶解，4 ℃避光貯存)；二甲基亞砜等材料試劑.此外本次試驗(yàn)使用的小花清風(fēng)藤采收于廣西省百色市那坡地區(qū)，經(jīng)本院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊進(jìn)教授鑒定為清風(fēng)藤屬植物小花清風(fēng)藤SabiaparvifloraWall. ex Roxb.

1.2 小花清風(fēng)藤提取方法

小花清風(fēng)藤莖葉陰干后，粉碎過100目篩.準(zhǔn)確稱取10 g藥粉，分別按照料液比1∶10、 1∶20、 1∶30加入純水，浸泡30 min，分別在60 ℃、80 ℃、100 ℃的水浴鍋中加熱1 h、2 h、3 h，用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，濃縮定容至總體積為 500 mL 后，冷凍干燥，直至成干膏.

1.3 細(xì)胞LO2的復(fù)蘇與培養(yǎng)

人正常肝細(xì)胞株LO2購自北納生物科技有限公司.預(yù)熱培養(yǎng)基，30 min后，向培養(yǎng)瓶中加入8.0 mL已預(yù)熱的培養(yǎng)基，取出凍存于液氮中的LO2細(xì)胞株，迅速投至37 ℃的水浴鍋中，不斷振搖.取出凍存管，75%酒精擦洗消毒，將凍存的細(xì)胞懸液吸至培養(yǎng)瓶中，混和均勻后，移入培養(yǎng)箱中37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞單層長到80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化，傳代.將處于對數(shù)生長期的肝細(xì)胞LO2用0.25%胰蛋白酶消化，然后用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基懸浮，用玻璃管輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，倒置顯微鏡下用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個·mL-1.將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 mL，置于37 ℃、5%CO2的孵箱培養(yǎng)24 h.

1.4 保肝活性測定

1.4.1 肝損傷模型建立 采用上述方法培養(yǎng)細(xì)胞并分為模型組和空白對照組，吸取10 mLCCl4溶于100 mL的含10%FBS的1640培養(yǎng)基中，制成飽和的CCl4培養(yǎng)基溶液；模型組加入含CCl4飽和的培養(yǎng)基溶液100 mL/孔，空白對照組加入含10%FBS的1640培養(yǎng)基100 mL/孔，將加好溶液的培養(yǎng)板置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.采用四唑鹽(MTT)比色法對比模型組與空白對照組的LO2肝細(xì)胞存活率，模型組LO2肝細(xì)胞存活率顯著低于空白對照組即為造模成功.

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 實(shí)驗(yàn)分為正常組(空白對照組)、模型組、給藥組(高、中、低劑量).吸取10 mLCCl4溶于100 mL的含10%FBS的1640培養(yǎng)基中，制成飽和的CCl4培養(yǎng)基溶液.用飽和的CCl4培養(yǎng)基溶液溶解藥物致不同濃度，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，藥物濃度為藥液終濃度為25、50、100 μg·mL-1，正常組加入含10%FBS的1640培養(yǎng)基100 mL·孔-1，模型組加入含CCl4飽和的培養(yǎng)基溶液100 mL·孔-1，給藥組加入樣品溶液100 mL/孔，將加好溶液的培養(yǎng)板置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.

1.4.3 肝細(xì)胞L-O2存活率測定 采用四唑鹽(MTT)比色法，測定前4 h，每孔加入20 μL的MTT液(5 mg·mL-1)，終止培養(yǎng)，吸棄上清，加入DMSO 150 μL·孔-1，待結(jié)晶溶解后，于全自動酶標(biāo)光度計492 nm處，測定每孔的吸光度值，計算肝細(xì)胞LO2的存活率.

采用該方法測定提取時間、提取溫度和料液比3個因素對小花清風(fēng)藤水提取肝保護(hù)活性的影響，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗(yàn)優(yōu)化小花清風(fēng)藤的最佳提取工藝條件.

1.5 統(tǒng)計分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素分析、正交試驗(yàn)設(shè)計和顯著性差異統(tǒng)計方法進(jìn)行處理和分析.正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)由Minilab軟件分析處理.

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

如表1所示，1、2、3組實(shí)驗(yàn)考察提取時間對提取物活性的影響，4、5、6組實(shí)驗(yàn)考察料液比對提取物活性的影響，7、8、9組實(shí)驗(yàn)考察提取溫度對提取物活性的影響.

表1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表1

2.1.1 提取時間對提取物活性的影響 從圖1可見，在提取時間為3 h的條件下，得到的提取物加入被CCl4損傷后的LO2細(xì)胞的活度更接近正常的LO2細(xì)胞，但考慮在成本情況下，提取時間不再延長，因此正交試驗(yàn)選擇提取時間為1 h、2 h、3 h的3 個水平來進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

圖1 提取時間對提取物的肝保護(hù)活性的影響Fig.1 Effect of extraction time on liver protective activity of extracts

2.1.2 料液比對提取液活性的影響 從圖2可見，在料液比為 1:20的條件下，得到的提取物加入被CCl4損傷后的LO2細(xì)胞的活度更接近正常的LO2細(xì)胞，因此正交試驗(yàn)選擇料液比為1∶10、1∶20、1∶30的3個水平來進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

圖2 料液比對提取物肝保護(hù)活性的影響Fig.2 Effect of feed-liquid ratio on liver protective activity of extracts

2.1.3 提取溫度對提取物活性的影響 從圖3可見，在提取溫度為100 ℃的條件下，得到的提取物加入被CCl4損傷后的LO2細(xì)胞的活度更接近正常的LO2細(xì)胞，考慮到水常壓下的沸點(diǎn)是100 ℃，因此正交試驗(yàn)選擇提取溫度為 60 ℃、80 ℃、100 ℃的3個水平來進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

圖3 提取溫度對提取物肝保護(hù)活性的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on liver protective activity of extracts

此外本次單因素試驗(yàn)的給藥組設(shè)計了3個濃度，分別為25 μg·mL-1、50 μg·mL-1和100 μg·mL-1，結(jié)果表明在9組試驗(yàn)中100 μg·mL-1的藥液活性較高，因此在正交試驗(yàn)中給藥組的藥液濃度為100 μg·mL-1.

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定正交因素水平表(表2)，正交試驗(yàn)結(jié)果(表3)，其中因素A、B、C分別代表提取時間、提取溫度及料液比.觀察表3中K值可知: 料液比因素，K2最大，所以因素C選擇水平為1∶20.提取溫度因素，K2最大，所以因素B選擇水平為 80℃.同理看出提取時間因素中選擇的水平為 1 h.因此，9次正交試驗(yàn)最優(yōu)提取工藝為A1B2C2，即料液比為1∶20，提取時間為1 h，提取溫度為80 ℃.觀察R值可知：RB>RC>RA，則其影響順序?yàn)锽>C>A，即提取溫度>料液比>提取時間.

表2 正交因素水平表

注：A=提取時間/h，B=提取溫度/℃，C=料液比

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用Minilab統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)的結(jié)果分析(表4)，方差分析表明因素A對其提取效果的影響具有明顯的顯著性.比較F值，有FB>FC>FA，可知在本實(shí)驗(yàn)中影響提取物活性A、B、C三因素中的影響次序是B>C>A，與計算結(jié)果一致.

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照最佳提取條件A1B2C2提取3次進(jìn)行條件驗(yàn)證，結(jié)果細(xì)胞存活率115.05%、115.15%、116.60%為正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)中最佳，RSD=0.75%，表明選擇的提取工藝合理.

3 討論

本文采用正交試驗(yàn)與保肝活性評價相結(jié)合的方法優(yōu)選小花清風(fēng)藤中活性成分的提取方法，結(jié)果表明3個因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響從大到小依次為提取溫度、料液比、提取時間，其最佳提取工藝為料液比為1∶20，80 ℃提取2 h.本試驗(yàn)以提取物的肝保護(hù)活性為指標(biāo)研究小花清風(fēng)藤的提取工藝，該方法不同于劉易蓉、潘國吉等[17-19]以小花清風(fēng)藤中槲皮素、齊墩果酸及黃酮等物質(zhì)基礎(chǔ)為指標(biāo)研究其提取工藝.

此外李玉玲等[13]研究表明小花清風(fēng)藤對CCl4致小鼠急性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，可減輕CCl4對肝臟的脂質(zhì)過氧化損傷，降低肝組織中ALT和AST活性，升高肝組織中SOD和GSHPx含量， 降低肝組織中MDA含量，從而減輕CCl4對肝組織氧化應(yīng)激損傷，改善肝臟病理組織學(xué)形態(tài)，保護(hù)肝細(xì)胞從而恢復(fù)肝功能，并驗(yàn)證其作用機(jī)制與其抗氧化作用有關(guān).本次試驗(yàn)按照中藥提取條件的常規(guī)設(shè)計[20]，在本文的方法下提取得到的提取物對CCl4損傷后的LO2細(xì)胞的細(xì)胞存活率為115.60%，活性相對較高，且該方法精密度與重復(fù)性都較好，為進(jìn)一步開發(fā)與利用小花清風(fēng)藤提供了科學(xué)依據(jù).