陳亞楠， 邵淑麗,2Δ， 何孟奇， 黃 鑫， 張偉偉,2， 張珍珠,2

(1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院, 齊齊哈爾 161000; 2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 齊齊哈爾 161000)

胃癌(gastric carcinoma, GC)是一種預(yù)后極差的惡性腫瘤[1]。目前早期胃癌已經(jīng)能夠得到較好的控制，晚期胃癌仍以化療為主要治療方式且難以治愈[2]。盡管化療的方法在治療胃癌中起到顯著作用，但是化療時(shí)間長(zhǎng)，價(jià)格高昂，且對(duì)患者身心造成一定傷害，因此急需尋找合適的胃癌治療藥物。在胃癌治療中，化療藥物5-Fu具有較大的毒副作用，如能尋找一種毒副作用較低的抗癌新藥，將會(huì)對(duì)胃癌治療提供新的方向。以往研究發(fā)現(xiàn)，已有多種天然產(chǎn)物在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用。

樺木酸(betulinic acid，BA)是一種天然存在于樺樹(shù)皮中的五環(huán)三萜類(lèi)化合物，具有抗病毒、抗炎癥的作用[3,4]。已有研究表明，樺木酸可以通過(guò)誘導(dǎo)線粒體凋亡，進(jìn)而抑制耐紫杉醇人肺癌H460細(xì)胞增殖[5]；還可通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)抑制胰腺癌細(xì)胞增殖[6]。然而，樺木酸對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖影響的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)以人胃癌SGC-7901細(xì)胞為研究對(duì)象，探究樺木酸對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及其對(duì)細(xì)胞周期的影響, 為樺木酸在治療胃癌方面的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

胎牛血清(Biological Industries，以色列)；樺木酸(漢博生物，上海)；5-氟尿嘧啶(生工生物，上海)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))；吉姆薩染液(普立科生物，重慶)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金生物，北京)；UN1Q-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒、全蛋白提取液、Power 2×SYBR real-time PCR premixture試劑(百泰克生物，無(wú)錫)；cyclin B1、cyclin D1、β-actin抗體(博奧森，北京)；BeyoClickTMEdU-488體外成像試劑盒(碧云天生物，上海)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制

用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞的RPMI 1640完全培養(yǎng)基含有10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素；細(xì)胞的培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2以及飽和濕度；20 mg樺木酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于4 ml DMSO后分別配置成終濃度為10 μg/ml，20 μg/ml，40 μg/ml，80 μg/ml，100 μg/ml的工作液；陽(yáng)性對(duì)照組將1 mg 5-Fu溶于5 ml DMSO中后由培養(yǎng)基配置成終濃度為30 μg/ml工作液[7]。

1.4 臺(tái)盼藍(lán)拒染法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線

將細(xì)胞以1×105cells/ml濃度接種于6孔板中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；樺木酸處理后培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后收集細(xì)胞進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；計(jì)算半數(shù)抑制濃度值IC50值。細(xì)胞的增殖抑制率=1-(試驗(yàn)組的平均活細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組的平均活細(xì)胞數(shù))×100%。并繪制生長(zhǎng)抑制曲線。

1.5 GIEMSA染色法檢測(cè)克隆形成率

將人胃癌SGC-7901細(xì)胞于6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，加入不同濃度的樺木酸處理48 h，當(dāng)6孔板中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。多聚甲醛固定后使用GIEMSA染色20 min后于倒置顯微鏡下對(duì)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算克隆形成率。

1.6 EdU法檢測(cè)細(xì)胞的增殖

將人胃癌SGC-7901細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)，分別加入不同濃度的樺木酸，處理48 h后按照BeyoClickTMEdU-488體外成像試劑盒操作方法對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

人胃癌SGC-7901細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中, 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。加入不同濃度的樺木酸處理48 h, 通過(guò)收集細(xì)胞、重懸、染色、上機(jī)的流程，具體按照Chen Z等人[8]的方法進(jìn)行操作。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)cyclin B1、cyclin D1的mRNA表達(dá)

在細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以不同濃度的樺木酸處理, 培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞, 提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，所用引物序列見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt計(jì)算獲得細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin B1、cyclin D1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

Tab. 1 Primer sequences for qRT-PCR analysis

1.9 Western blot檢測(cè)cyclin B1、cyclin D1的蛋白表達(dá)

細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入不同濃度的樺木酸處理48 h后，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育/二抗孵育[9]后用紅外激光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線

利用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)樺木酸對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并繪制生長(zhǎng)抑制曲線。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著處理時(shí)間增加，細(xì)胞抑制率逐漸增大，說(shuō)明樺木酸能夠抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，且呈時(shí)間和劑量依賴性(表2)。樺木酸分別處理24 h、48 h、72 h后人胃癌SGC-7901細(xì)胞的IC50值分別為44.046 μg/ml、21.055 μg/ml、 10.338 μg/ml。

Tab. 2 The growth inhibition rate of SGC-7901 cells (n=3)

2.2 樺木酸對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞克隆形成率的影響

為研究樺木酸對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞克隆形成率的作用，通過(guò)不同濃度的樺木酸處理細(xì)胞48 h后，采用GIEMSA染色檢測(cè)細(xì)胞克隆形成率的情況。與樺木酸0 μg/ml組和5-Fu對(duì)照組相比，隨樺木酸濃度增加，細(xì)胞克隆形成率均顯著下降(P均< 0.05,表3)，且在樺木酸濃度為30 μg/ml時(shí)下降最顯著(P<0.01,表3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樺木酸能夠抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖。

Tab. 3 Effects of betulinic acid on the clone formation rate of human gastric cancer SGC-7901 cells (%,

2.3 樺木酸對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

用不同濃度的樺木酸處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后，采用EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。如圖1、表4所示，與樺木酸0 μg/ml組相比，隨樺木酸濃度的增加，細(xì)胞增殖率顯著降低，分別降低19.94%，30.16%，35.16%(P均<0.05)。與5-Fu陽(yáng)性對(duì)照組相比，樺木酸濃度為20 μg/ml，30 μg/ml時(shí)，細(xì)胞增殖率均顯著低于5-Fu組(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樺木酸能夠顯著抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖(圖1，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅲ)。

Fig.1 Effects of BA on SGC-7901 cells proliferation（Bar=50 μm，n=3）

Tab. 4 The relative EdU positive n=3)

2.4 樺木酸對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞周期的影響

不同濃度樺木酸作用48 h后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樺木酸對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞周期的影響。與樺木酸0 μg/ml組相比，隨著樺木酸濃度增加，G0/G1期細(xì)胞所占比例顯著升高，而S期和G2期細(xì)胞所占比例顯著降低(P均<0.05,表5)，10 μg/ml樺木酸處理的效果與陽(yáng)性對(duì)照5-Fu處理效果相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明樺木酸將人胃癌SGC-7901細(xì)胞阻滯在G1/G0期，從而抑制細(xì)胞增殖。

Tab. 5 Changes of cell cycle after treated with n=3)

2.5 樺木酸對(duì)細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1 mRNA表達(dá)的影響

用不同濃度樺木酸處理細(xì)胞48 h后，利用qRT-PCR分析細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的mRNA表達(dá)情況。與樺木酸0 μg/ml相比，不同濃度樺木酸處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞，cyclin D1和cyclin B1的mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.01,表6)，10 μg/ml樺木酸處理的效果與陽(yáng)性對(duì)照5-Fu的效果相似。

Tab. 6 The effects of BA on mRNA levels of cyclin D1 and cyclin n=3)

2.6 樺木酸對(duì)細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1蛋白表達(dá)的影響

不同濃度樺木酸處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞48 h后，利用Western blot檢測(cè)cyclin D1和cyclin B1蛋白的表達(dá)。如圖2、表7所示。與樺木酸0 μg/ml相比，不同濃度樺木酸處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞，cyclin D1和cyclin B1的mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)，10 μg/ml樺木酸處理的效果與陽(yáng)性對(duì)照5-Fu的效果相似。表明隨樺木酸可以降低人胃癌SGC-7901細(xì)胞周期蛋白表達(dá)。

Fig. 2 The effects of BA on protein levels of cyclin D1 and cyclin B1

Tab. 7 The effects of BA on protein levels of cyclin D1 and cyclin B1

3 討論

胃癌作為引起人類(lèi)死亡的主要原因之一，越來(lái)越受到大家的關(guān)注[10]。迄今為止，化療是治療腫瘤最常規(guī)的手段，其作用機(jī)制是通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，從而有效控制腫瘤的發(fā)展。5-Fu作為胃癌治療常規(guī)的化療用藥已廣泛使用，但其治療劑量與中毒劑量極為接近，毒副作用較大[11]。與化療藥物相比，中草藥具有毒副作用較小、價(jià)格相對(duì)便宜等特點(diǎn)。目前，黃芩素已被證實(shí)能夠抑制口腔癌細(xì)胞增殖[12]，同時(shí)，楊芽黃素也被報(bào)道與前列腺癌凋亡相關(guān)[13]。除此以外，雷公藤堿等多種天然產(chǎn)物均已在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面取得較為顯著的效果[14]。樺木酸是從樺樹(shù)皮中提取的天然成分，已被發(fā)現(xiàn)具有抑制腫瘤增殖的作用。相關(guān)研究表明，樺木酸通過(guò)誘導(dǎo)卵巢癌A2780細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖[15]。在乳腺癌MCF-7細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，樺木酸可激活GRP78觸發(fā)ER應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[16]，以及通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路調(diào)控宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖等功能[17]。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)以5-Fu處理組為陽(yáng)性對(duì)照，首先通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)拒染法、GIEMSA染色法、EdU等實(shí)驗(yàn)手段，探究樺木酸對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨樺木酸濃度升高，SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著升高，克隆形成率和細(xì)胞增殖率均明顯降低?？梢?jiàn)樺木酸可以抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖。

細(xì)胞周期的失調(diào)是癌癥惡性增殖的標(biāo)志[18]。細(xì)胞周期由相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白所調(diào)控[19]，其中cyclin B1和cyclin D1可以分別調(diào)控細(xì)胞G2/M和G1/S期的轉(zhuǎn)換過(guò)程，在細(xì)胞周期調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)首先利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樺木酸處理48 h后人胃癌SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)隨樺木酸濃度升高，細(xì)胞G1/G0期細(xì)胞占比顯著升高；隨后通過(guò)qRT-PCR和Western blot分別檢測(cè)相關(guān)cyclin B1、cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，cyclin B1、cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，進(jìn)而影響細(xì)胞周期，且在樺木酸濃度為30 μg/ml效果最顯著。

綜上所述，樺木酸通過(guò)下調(diào)cyclin B1和cyclin D1基因和蛋白表達(dá)，將人胃癌SGC-7901細(xì)胞阻滯在G1/G0期，從而抑制細(xì)胞增殖，為樺木酸的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。