（廣東正孚法醫(yī)毒物司法鑒定所，廣東廣州 510663）

1 案例檢驗

1.1 檢材來源

受交警委托，本單位受理了1 例在交通事故身亡的死者肋軟骨，要求將死者與疑似父母進(jìn)行親權(quán)鑒定。送檢的肋軟骨呈淡黃色，表面附著灰褐色腐肉。

1.2 DNA提取

先去除肋軟骨周圍的腐敗組織等表面垢物，用滅菌超純水沖洗干凈。用干凈手術(shù)刀片切除四周后從深中部切取5mm×5mm×1mm 共2份肋軟骨，放入1.5mL 離心管中，分別用Chelex-100 法和QIAamp DNA Investigator 試劑盒（硅珠法）進(jìn)行提取。

1.2.1 Chelex-100法

加入300μL 5%Chelex-100、10mg/mL 蛋白酶K 10μL，56℃消化2h，期間多次渦旋混勻，置于98℃加熱煮沸10min，13000r/min 離心5min，取上清備用。

1.2.2 硅珠法

按照德國QIAGEN 公司的QIAamp DNA Investigator試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取操作。

1.3 DNA擴(kuò)增及電泳

選用Thermo Fisher 公司的華夏白金試劑盒，擴(kuò)增體系為15μL，取DNA上清2μL，加入Master Mix 6μL、Primer Mix 6μL、PnG Buffer 1μL。同時設(shè)置陰陽性對照。

擴(kuò)增參數(shù)：95℃變性1min；94℃3s、59℃16s、65℃29s，30 個循環(huán)；60℃終延伸15 min；4℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增產(chǎn)物在3130XL遺傳分析儀上電泳，數(shù)據(jù)經(jīng)GeneMapper ID-X 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 采用Chelex-100法和QIAamp DNA Investigator 試劑盒法提取腐敗肋軟骨DNA，結(jié)果顯示，用Chelex-100法提取的DNA未得到有效擴(kuò)增（見圖1）；而用硅珠法提取的DNA，包括1 個Amelogin 位點、1 個Y-Indel 位點在內(nèi)，共25個基因座獲得成功分型（見圖2）。

2.2 將死者肋軟骨STR 分型數(shù)據(jù)與疑似父母的分型結(jié)果進(jìn)行比對分析，死者所有基因座上的等位基因均能從疑似父母雙方找到來源，按照GB/T37223-2018進(jìn)行親權(quán)指數(shù)的計算，累積親權(quán)指數(shù)CPI均大于10000，達(dá)到認(rèn)定親權(quán)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 Chelex-100法

3 討論

對于新鮮肋軟骨，直接擴(kuò)增法或Chelex-100法便可成功獲得STR分型［1～3］。但在實際檢案中發(fā)現(xiàn)［4］，肋軟骨的腐敗程度與年齡、死亡時間、離體時間、保存條件等相關(guān)，可表現(xiàn)為色澤、氣味等方面的變化。兒童、嬰幼兒因其體內(nèi)水分比例較成年人高，故死后變化發(fā)展較快，肋軟骨腐敗程度較成年人要高。死者年齡越大，肋軟骨鈣化程度越高，色澤上常呈黃色。死亡或離體時間較長且保存不當(dāng)?shù)睦哕浌且踩菀壮霈F(xiàn)腐敗，在色澤上多表現(xiàn)為灰黑色，且常在微生物的分解下產(chǎn)生難聞的氣味。提取肋軟骨DNA前，首先通過最直觀的色澤與色味可初步判斷肋軟骨是否有腐敗跡象，以便高效選擇適宜的DNA提取方法。

本單位受理的該例肋軟骨，來自一名兒童，檢材表面附著大量灰褐色組織，有氣味產(chǎn)生，提示已出現(xiàn)腐敗，狀態(tài)較差。采用Chelex-100 法未能獲得有效STR 分型的原因，很可能是檢材因腐敗而攜帶了較多影響下一步PCR 反應(yīng)的抑制物，而Chelex-100 法純化該類腐敗檢材DNA 的能力有限，故未獲得足量純度高的DNA 模板，最終導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。而QIAamp DNA Investigator 試劑盒的原理是硅珠法。該法通過裂解消化，過二氧化硅膜柱子特異吸附，反復(fù)漂洗等純化步驟，洗脫后的DNA較純，利于下一步擴(kuò)增。這也是該例腐敗肋軟骨更換試劑盒提取方法后成功檢出STR分型的重要原因。

圖2 硅珠法

實驗中還須注意幾點：（1）切取的肋軟骨切片大小須適中，厚度應(yīng)小于1mm，并適當(dāng)剪碎以促進(jìn)DNA釋放；（2）根據(jù)檢材狀態(tài)，嚴(yán)重腐敗的肋軟骨要適當(dāng)增加取材量；（3）為減少抑制物的影響，應(yīng)盡量選取腐敗程度較小的中間部位。本案中筆者用手術(shù)刀片切除肋軟骨表面灰褐色腐敗部分，為避免帶入刀片上附著的腐敗組織，更換了新的刀片再切取中間部位；（4）必要時增大擴(kuò)增體系以降低抑制物的濃度。

綜上所述，提取肋軟骨的DNA，要注意結(jié)合案情，盡量了解死者的年齡、死亡時間、環(huán)境因素等，并觀察肋軟骨的色澤，以便更好地判斷肋軟骨的腐敗情況，從而選擇更合適的提取方法。對于腐敗肋軟骨，可直接選用包含純化步驟的提取方法（如硅珠法、磁珠法等），既可保證檢出率，又可避免多次檢驗，減少檢材浪費(fèi)，縮短檢驗時間。