銅對植物生長及葉組分的影響研究

王鈺博，宋煕臨，何 欣，徐逸北，楊麗麗，劉春玲

(沈陽理工大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，沈陽110159)

土壤中銅含量的正常范圍為2～200mg/kg，平均值是22.6mg/kg。隨著三廢排放、礦業(yè)開采、含銅殺菌劑的使用等，土壤含銅量可能高出當?shù)乇尘爸档膸妆兜綆资?。土壤承載不了嚴重的重金屬污染，動植物和微生物也會受到危害，更嚴重的是威脅到生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和人類的安全，因此，土壤中銅的污染引起了人們的廣泛重視。

生態(tài)系統(tǒng)破壞的一個關(guān)鍵指示是植被的生長發(fā)育狀況。植物在生長過程中，通過根部吸收地下的重金屬元素并向地上莖、葉部位運輸遷移和聚集。重金屬對植物的毒害效應(yīng)發(fā)生在當其在植物體內(nèi)的積累超過毒性閾值時，此時由于植物根部受損等原因，致使植物對營養(yǎng)物質(zhì)和必需微量元素的吸收困難，這些生命物質(zhì)的缺乏導(dǎo)致植物生理代謝功能紊亂，從而出現(xiàn)葉內(nèi)色素的組分和含量的變化、葉內(nèi)細胞結(jié)構(gòu)的變化、水分含量的變化、顏色的變化、葉面溫度的變化、葉冠結(jié)構(gòu)的變異等[1-6]。這些葉片特征的變化成為利用高光譜進行土壤環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測的依據(jù)。

本文以大葉空心菜為供試植物，研究土壤中不同濃度銅對大葉空心菜生長高度、葉綠素及銅含量的影響，同時根據(jù)空心菜的生長高度和葉綠素含量的變化，研究土壤中銅對空心菜的毒性刺激閾值，并對葉中銅含量與葉綠素含量之間關(guān)系進行擬合分析，探索空心菜受銅影響的機理。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

(1)供試植物：大葉空心菜。

(2)供試土壤：取0～20cm的農(nóng)田表層土攪拌均勻，然后經(jīng)過自然風(fēng)干、棍棒壓碎翻動，揀除植物殘體、碎石以及砂礫等雜物后，過100目篩。供試土壤的pH值為7.25，接近中性。供試土壤中主要重金屬的含量如表1所示。

表1 土壤中多種重金屬各自的含量 mg/kg

(3)供試試劑：采用硫酸銅溶液用于提供交換態(tài)的Cu2+，浸提劑為95%乙醇，消解采用濃硝酸和氫氟酸，均為優(yōu)級純或分析純。土壤基肥選用無機氮磷鉀。

(4)設(shè)備：超聲波清洗儀，磁力攪拌器，火焰原子吸收分光光度計，干燥箱，721紫外-可見分光光度計，微波消解儀，瑪瑙研缽等。

1.2 試驗方法

植物細胞壁的主要成分包括大分子的纖維素、果膠和蛋白質(zhì)，均含有負電基團，如羥基、羧基、醛基、氨基和磷酸基團等，因此細胞壁帶有一定程度的負電性，能夠吸收環(huán)境中的陽離子。由此本研究選用陽離子Cu2+作為供試重金屬元素，且以硫酸銅溶液形式加入到土壤中。試驗將硫酸銅溶液采用逐層噴灑、翻土混合的方式加入土壤中，充分混勻得到土壤中銅濃度(以Cu2+計)水平分別為0、100、200、400、600、800、1000、1500、2000mg/kg。每種濃度土壤加入無機氮磷鉀基肥，施加濃度為：N 200mg/kg，P 80mg/kg，K 100mg/kg。土壤每天翻動混勻，平衡一周以上，栽種大葉空心菜；同時設(shè)置2～3組平行樣。氣溫為23～36℃。植物培養(yǎng)期間，每天澆蒸餾水，生長36d后，進行葉綠素總量和葉片中銅含量等生化組分的測定。

1.3 組分的測定

(1)土樣pH值的測定：玻璃電極法。采用土液比1∶2.5進行配比，取過20目風(fēng)干土樣10g(精確至0.01g)于小燒杯中，加入無CO2的超純水25mL，用塑料膜封好燒杯，防止空氣中CO2溶于水中，放在磁力攪拌器上攪拌30min，然后靜置30min，測量前輕微搖動，用酸度計測量上清液的pH值。

(2)土壤和空心菜葉片中銅含量的測定：樣品預(yù)處理后[7]，采用HNO3-HF濕法消解后再用火焰原子吸收分光光度法測定。稱取約0.2g風(fēng)干土壤樣品于消解罐中，然后加入濃HNO38mL+HF 2mL，于近190℃高壓微波消解約50min。180℃趕酸2h，趕盡白煙，蒸至近干，用1% HNO3溶液定容于100mL容量瓶中待測，同時制作試劑空白、過程空白、樣品空白。

(3)葉綠素的浸提與測定：Arnon法。利用有機溶劑能溶解葉綠素的特性，將0.26～0.27g剪碎的葉片在有機溶液中研磨，然后加入95%乙醇在超聲波儀器中黑暗浸提，再過濾定容至25mL，用紫外-可見分光光度計測定葉綠素提取液的光密度值(OD)，根據(jù)Lambert-Beer定律計算葉綠素含量。葉綠素的計算公式為

Ca=12.70A663-2.69A645

(1)

Cb=22.9A645-4.68A663

(2)

CT=Ca+Cb=20.21A645+8.02A663

(3)

式中：Ca為葉綠素a濃度，mg/L；Cb為葉綠素b濃度，mg/L；CT為葉綠素總濃度，mg/L；A663為試劑在波長663nm處的吸光度；A645為試劑在波長645nm處的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 空心菜株高

播種36d后，外源銅施加濃度(以Cu2+計)分別為0、100、200、400、600、800、1000、1500、2000mg/kg的土壤中空心菜的生長狀況和生長高度分別如圖1和圖2所示。

由圖1、圖2可以看出，隨著銅的增加，空心菜生長高度呈下降趨勢，空心菜生長高度與土壤中銅的含量之間的相關(guān)系數(shù)達到-0.967。外源銅施加濃度為0～200mg/kg時空心菜的生長高度最高。其中，銅施加濃度為100mg/kg的土壤中空心菜的株高最大，為22.8cm；其次是無外源銅加入時；再次是外源銅施加濃度為200mg/kg時。

依據(jù)圖2空心菜的生長高度，初步確定0～200mg/kg的外源銅施加濃度作為空心菜生長的銅毒性刺激閾值。位于銅毒性刺激閾值時，隨著土壤銅濃度的增加，銅作為一種必需的微量元素有利于空心菜的生長，其生長高度有不同程度的增加。高于銅毒性閾值時，銅對空心菜生長的毒害效應(yīng)越來越大。圖2中銅毒害效應(yīng)對生長高度的影響，表現(xiàn)在銅處理濃度為800mg/kg及以下的土壤中葉片濃綠，差別不大。隨著供試元素銅含量的繼續(xù)增加，根部越發(fā)受到損傷，植物開始散失水分調(diào)控能力，根部不能吸收足量的水分和所需的營養(yǎng)物質(zhì)以供植株正常生長。吸水能力差導(dǎo)致植株出現(xiàn)各種病癥，出現(xiàn)一定程度的脫水干枯，有的新葉皺縮卷曲，老葉出現(xiàn)枯萎發(fā)黃、葉面布有枯斑、光澤暗淡的癥狀。銅處理濃度為1000mg/kg時，此時植物生長發(fā)育遲緩，生物量嚴重降低。當土壤中銅增至1500～2000mg/kg時，空心菜外觀健康狀況很差，生長高度恒定在5.6cm，且保持幼苗期狀態(tài)生長停滯，葉片部分萎黃、卷葉、落葉、葉小和出現(xiàn)死斑，甚至由于細胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞而導(dǎo)致植物死亡。在生長高度方面，表現(xiàn)出明顯的“低濃度銅促進、高濃度銅抑制”的規(guī)律[8]。

低濃度污染對于生物體可能具有刺激作用，即Hormesis效應(yīng)(毒物興奮效應(yīng))，就是化學(xué)物對生物體在高劑量時表現(xiàn)負面影響，生長、發(fā)育受抑，但在低劑量時卻表現(xiàn)為有益作用的現(xiàn)象，刺激生長發(fā)育。通過實驗數(shù)據(jù)的觀察，空心菜在刺激閾值以下的低濃度銅含量時具有該效應(yīng)；但隨著銅的增加，銅在空心菜體內(nèi)不斷積累，使得Hormesis效應(yīng)消失，銅對葉綠素的含量也造成了嚴重破壞，光合作用減弱，銅對空心菜生長的抑制效應(yīng)顯著增加。

2.2 不同銅添加濃度土壤中空心菜的銅含量

圖2中，土壤的銅濃度不高于800mg/kg時，宏觀觀察認為空心菜生長近似正常，不同濃度間表現(xiàn)出的差異較小。葉綠素含量的變化一定程度上能夠真正反映植物生長狀況正常與否，因而測定空心菜葉片中的葉綠素及銅含量以考查不同濃度之間存在的差異性。圖3為不同外源銅施加濃度土壤中空心菜葉綠素a、b及總量的變化。圖4為土壤外源銅添加量對應(yīng)的葉綠素a/b比值及葉中銅的含量。

從圖3、圖4可以看出，葉綠素a遠高于b的含量，a受銅濃度的變化影響比較明顯，隨著土壤中銅含量的增加，a從1.47mg/g降低到0.35mg/g。b含量較低，且受銅影響的變化無明顯規(guī)律，葉綠素b的實際含量很低，人為操作引起的誤差也略大一些。葉綠素a、b最高濃度均出現(xiàn)在無外源銅施加時，此時土壤的總銅為54.01mg/kg。再依據(jù)空心菜的生長高度，最終確定將土壤總銅含量為54.01mg/kg作為空心菜生長的銅毒性刺激閾值。

葉綠素主要組分a的含量與葉中銅含量的相關(guān)系數(shù)為-0.558，葉中的銅含量越高，a的含量就越低，說明運輸遷移到葉中的銅對光合色素細胞產(chǎn)生毒性，葉綠素的合成受到銅的明顯抑制。a與土壤中銅含量的相關(guān)系數(shù)為-0.844，高于其與葉中銅的含量，表明葉綠素含量不只是受到葉中銅的抑制，與土壤中銅含量之間的關(guān)系更為密切。生物體作為一個復(fù)雜的有機體，葉綠素a的合成和分解受到多方面的作用。

圖4中隨著土壤中銅的增加，葉片中銅含量波動上升，葉綠素a/b值和葉綠素總量(a+b)整體呈下降趨勢。

空心菜葉中葉綠素含量降低的原因很多，可能是原有的葉綠素受到破壞和分解加快，或葉綠素的合成受阻，從而出現(xiàn)葉片褪綠、黃化或花葉等癥狀。機理可能是銅與葉綠體中某種蛋白質(zhì)結(jié)合或取代其中的Fe2+離子和Mg2+離子等，破壞了葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能，使葉綠素破壞和分解加劇。Webber M B等[9]認為是由于重金屬抑制葉綠素酸酯還原酶和影響了氨基-γ-酮戊酸的合成，而這2個酶對于葉綠素的合成是必須的?？招牟耸芡寥乐懈邼舛茹~毒害(Cu2+離子濃度不低于1000mg/kg)，通過影響植物新陳代謝活動導(dǎo)致葉子感觀上呈現(xiàn)失綠發(fā)黃并伴有褐斑的異?，F(xiàn)象；葉綠素a與b的比值減小，光合系統(tǒng)I和II傳遞電子的能力降低，空心菜光合作用的速率下降[10]。究其原因，可能是空心菜體內(nèi)的銅過量時，降低了空心菜一些生長有益的抗性酶(如抗壞血酸過氧化物酶)等的活性，卻提高了能促進含氧自由基產(chǎn)生的酶(如過氧化氫酶的活性)。葉綠體的內(nèi)膜因為膜脂的過氧化而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)被打亂，葉綠素的氧化分解加快，最終表現(xiàn)在宏觀上失綠黃化。許多研究表明，植物葉綠素含量與多種抗病性密切相關(guān)。在逆境情況下，植物葉綠素含量降低，光合作用減弱，降低了植物的耐熱性和越夏能力，不能為植物提供充分的營養(yǎng)保障，生長過程緩慢，削弱了植物抵御病害的能力。

圖5為不同銅添加濃度土壤中空心菜根、莖、葉中銅的含量。根、莖、葉中銅含量與土壤的銅含量程度在0.01水平上顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.880、0.919、0.639。同一濃度下的銅含量比較，總是有：根>莖>葉。表明地下銅易于向空心菜地上部分運輸。

2.3 葉綠素與葉銅含量之間的回歸模型

對空心菜的葉銅含量(Cu)與葉綠素a(CHL a)含量、葉綠素總量(CHLa+b)、葉綠素含量a/b值、葉綠素b(CHLb)含量分別進行擬合分析，決定系數(shù)R2分別為0.729、0.621、0.461，葉綠素b含量與葉中銅含量之間沒有找到合適的數(shù)學(xué)模型。比較得知a對葉中銅含量的反應(yīng)最敏感，二者之間能建立多個效果良好的回歸方程。

(1)復(fù)合函數(shù)

lnCu=ln(56.455)+ln(0.643)·CHL a

(2)增長函數(shù)

lnCu=4.033-0.441·CHL a

(3)指數(shù)函數(shù)

lnCu=ln(56.455)-0.441·CHL a

(4)邏輯函數(shù)

ln(1/Cu)=ln(0.018)+ln(1.554)·CHL a

所有回歸模型的顯著性水平p<0.05，相關(guān)系數(shù)R=-0.854，決定系數(shù)R2=0.729，表明葉綠素a與葉銅含量之間的擬合效果較好，葉綠素隨葉銅增加而減少的原因，或是葉片中銅的積累對葉綠素細胞產(chǎn)生了毒性，使葉綠素的合成受到銅的明顯抑制，或是原有的葉綠素因受銅破壞而分解速率加快。

3 結(jié)論

(1)空心菜表現(xiàn)出明顯的“低濃度銅促進、高濃度銅抑制”的Hormesis效應(yīng)。確定土壤銅對空心菜的毒性刺激閾值為54.01mg/kg。

(2)空心菜的生長高度在外加銅濃度為800mg/kg以內(nèi)的土壤中差別不大；銅繼續(xù)增加，空心菜根部受損，散失水分調(diào)控能力，無法吸收足量的水分和營養(yǎng)，出現(xiàn)各種病癥，導(dǎo)致一定程度的脫水干枯和死亡。

(3)葉綠素a的含量與葉中銅含量的相關(guān)系數(shù)為-0.558，說明運輸遷移到葉中的銅對光合色素細胞產(chǎn)生毒性，葉綠素的合成受到銅的明顯抑制。a與土壤中銅含量的相關(guān)系數(shù)為-0.844，高于其與葉中銅含量的相關(guān)系數(shù)，表明葉綠素含量不只是受到葉中銅的抑制，與土壤中銅含量之間的關(guān)系更為密切。

(4)根、莖、葉中銅含量與土壤銅含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.880、0.919、0.639。同一濃度下的銅含量比較，總是根>莖>葉，表明地下銅易于向空心菜地上部分運輸。