朱立歡 王志安 熊漢忠 謝芳

在惡性腫瘤中，肺癌是全球死亡率最高的。肺癌的發(fā)病率每年超過160萬例，占所有癌癥新診斷病例的13%，每年有140萬人死亡，占所有癌癥相關死亡人數的18%[1]。在中國，與肺癌有關的死亡率和發(fā)病率每年都在增加[2]。80%以上肺癌的病理類型是非小細胞肺癌(NSCLC)。有些患者在手術后早期就有復發(fā)的危險，在化療和靶向治療過程中會出現耐藥性[3]。因此，需要更好地了解產生耐藥性的原因以及如何克服這種原因。非小細胞肺癌的分子機制尚不清楚，目前正在進行廣泛的研究[4]。實時定量RT-PCR(qPCR)技術在非小細胞肺癌的早期診斷、預后預測和基因表達分析等方面具有重要的應用價值[5]。許多基因與非小細胞肺癌的發(fā)生有關，如p53、Rb和Ras[6]。一項研究表明，186個microRNAs中有98個位于腫瘤相關基因組區(qū)或易碎位點[7]。例如，miR-99 a、let-7、miR-125 b-2位于肺癌的純合子缺失區(qū)，沒有已知的抑癌基因[8， 9]。一些microRNAs位于斷點的附近，其中miR-142位于涉及17號染色體和MYC的t斷裂的50個核苷酸處。這表明microRNAs可能在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關重要的作用。此外，microRNA的表達譜顯示許多腫瘤類型的特征性特征，是腫瘤分類、預后和治療結果的生物標志[9]。研究表明，HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b可通過調節(jié)CrK、VEGF和EGFL 7在NSCLC中抑制侵襲和增殖[10]。因此，目前證據似乎支持HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b與腫瘤生長相關。此外，與卡培他濱和奧沙利鉑一線治療無效患者相比，服用卡培他濱和奧沙利鉑的患者HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的表達水平顯著升高[11]?；谏鲜鰣蟮溃琀SA-miR30-5p和HSA-LIT-7b可能對癌癥有可能的預測和診斷價值[12]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者術前未接受放療和(或)化療。選擇2015年1月至2018年10月，98例新診斷的NSCLC患者和98例年齡和性別匹配的健康對照者。分別采集患者3 ml血，30 min內分離血清，-80℃保存，進行分析。收集后，所有組織樣品立即儲存在液氮中，直到使用?；颊?015至2018年隨訪，平均觀察44個月。根據美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)的標準確定臨床和臨床病理分級和分期。

1.2 miRNA定量實時PCR(qrt-PCR) 用Trizol試劑按生產工藝從血清中提取總RNA，在-80℃保存，待進一步加工。用100 ng總RNA合成cDNA。根據制造商的說明，使用Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR試劑盒(Ribobio)對HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b進行qRT-PCR。簡單地說，利用特定的HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b正向引物和U6的反向引物，從總RNA中合成了HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b和U6特異性的cDNA，然后利用ABI-Prism 7 900 HT系統(tǒng)(Applied Biosystems)進行了實時PCR和一個特定于HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的前向引物和一個通用的反向引物。每個樣本一式三份。以U6小核RNA為內源對照。計算每個樣本的HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的表達水平，用ΔCT值表示。用比較2ΔΔCT法分析同一患者成對組織中的HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的相對表達水平。

1.3 Western blotting 用細胞裂解緩沖液從培養(yǎng)細胞中提取總蛋白，然后在冰浴中孵育60 min，低溫離心15 min(12 000 r/min)。取上清液測定蛋白質濃度。用100 μg蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。用抗HSA-miR30-5p抗體和小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶單克隆抗體(GAPDH；1∶1 000；Abgent， CA， USA)在4℃上孵育一夜。膜用含吐溫-20的3次0.9%氯化鈉溶液沖洗3次(每次10 min)。加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶結合羊抗兔IgG抗體(二次抗體)，室溫孵育1.5 h。薄膜用吐溫-20洗3次。在凝膠成像系統(tǒng)中加入電化學發(fā)光試劑進行信號處理，用于圖像采集。相對HSA-miR30-5p含量以HSA-miR30-5p/GAPDH的灰度比值表示。用Quantity One software (Bio-Rad Laboratories， CA， USA)進行灰度分析。

1.4 細胞侵襲和細胞增殖實驗 跨孔細胞培養(yǎng)室(Millipore，Bedford，MA，USA)用基質包覆，37℃干燥后用培養(yǎng)基進行重組。細胞分為3組：對照組、PE-CMV組和PE-MIL 126組。轉染PE-CMV或PE-MIR 126的細胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓，在RMPI 1640培養(yǎng)基中以1×106/ml懸浮24 h。將300 ml細胞懸液置于上腔，37℃時允許遷移24 h。下腔室中的懸浮介質被移除。侵入濾器下部的細胞用4%多聚甲醛固定，用Gimsa溶液染色。在相差顯微鏡下，計算進入下腔的細胞數量。用10%FBS和100 mg/ml青霉素/鏈霉素在RMPI 1640中接種96孔板，培養(yǎng)72 h。3-(4，5-二甲基噻唑基-2)-2，5-二苯基四氮唑溴(MTT)法測定細胞增殖率。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測定法 人IL-4、IL-10、IL-21和干擾素γ(IFN-γ)ELISA試劑盒從eBioscience購買。人IGM、IgG和IgA試劑盒從ABCAM購買。所有的ELISAs都是按照制造商的指示執(zhí)行的。

2 結果

2.1 患者特征 本研究包括男70例，女28例；年齡32～75歲，平均年齡(54.37±10.77)歲；Ⅰ期15例，Ⅱ期14例，Ⅲ期25例，Ⅳ期44例；遠處轉移44例；吸煙者23例，不吸煙者54例。見表1。

表1 非小細胞肺癌患者的人口學特征

注：TNM：腫瘤淋巴結轉移

2.2 HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的表達與NSCLC 免疫組化結果提示HSA-miR30-5p主要位于細胞漿內。非小細胞肺癌組織中HSA-miR30-5p陽性表達率高于正常肺組織(70.8% vs 47.5%，Pearson’s χ2=13.521，P<0.01)。HSA-miR30-5p在腺癌和鱗癌組織中的陽性表達率分別為73.1%和67.9%。隨機抽取40例非小細胞肺癌組織標本和正常肺組織進行驗證。此外，用Western印跡法檢測HSA-miR30-5p蛋白的表達水平。HSA-miR30-5p在非小細胞肺癌組織中的表達明顯高于正常肺組織(P<0.01)。見圖1。

圖1 Western blotting定量檢測HSA-miR30-5p蛋白

注：圖中1、2分別為正常對照組與NSCLC患者組表達結果；泳道A、C為已知的NSCLC敏感基因miR-142表達結果，泳道B、D分別為HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b表達結果

2.3 HSA-miR30-5p表達和NSCLC患者的臨床病理特征 根據免疫組化結果，將NSCLC患者分為陽性表達組和陰性表達組。分析非小細胞肺癌(NSCLC)患者HSA-miR30-5p表達與臨床特征的關系。HSA-miR30-5p陽性表達與淋巴結轉移及腫瘤分期密切相關(均P<0.05)，但與年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、病理類型及分化程度無關(均P>0.05)。見表2。

2.4 HSA-miR30-5p表達與NSCLC患者預后分析 隨訪時間49～105個月，中位數81個月。Kaplan-Meier生存模型顯示，HSA-miR30-5p陽性表達組的存活時間明顯短于陰性表達組。分化較差、淋巴結轉移和晚期TNM分期的患者預后較差。見表3。

2.5 HSA-LIT-7b在NSCLC中的表達水平 在98例非小細胞肺癌患者中， HSA-LIT-7b的表達水平與性別、年齡、組織學類型或腫瘤分期無關。根據HSA-LIT-7b的表達水平分為2組：微RNA表達水平低于中位數的組和高于或等于HSA-LIT-7b表達水平中位數的組(中位數：0.654)。然而，Kaplan-Meier生存分析顯示，低表達的患者與高表達的患者相比，存活時間明顯縮短(P=0.005)。見表2、4。

表2 非小細胞肺癌患者HSA-miR30-5p的表達及臨床病理特征 例(%)

表3 98例非小細胞肺癌患者的整體生存情況

項目miR126P值性別 男(n=70)0.65±0.340.958 女(n=28)0.64±0.330.958年齡(歲) ≤55(n=55)0.65±0.320.786 >55(n=43)0.68±0.290.786是否吸煙 是(n=54)0.68±0.310.384 否(n=44)0.66±0.330.384組織學類型 腺癌(n=55)0.68±0.350.666 鱗狀細胞癌(n=43)0.66±0.310.666TNM分級 Ⅰ級(n=15)0.67±0.330.298 Ⅱ級(n=14)0.68±3.310.298 Ⅲ級(n=25)0.62±0.340.298 Ⅳ級(n=44)0.71±0.320.298

2.6 HSA-LIT-7b基因型的多態(tài)性及其與非小細胞肺癌的關系 我們對442例非小細胞肺癌患者和543例對照組的基因組DNA片段進行了測序，其中包括Pre HSA-LIT-7b及其相應的側翼區(qū)(6 200 Bp)。3個SNP分別為rs78 242 242、rs4 636 297和rs1 140 713。在本研究中，由于頻率很低，rs78 242 242和rs1 140 713沒有進行統(tǒng)計分析(數據未顯示)。正常對照組SNP(G>A，rs4 636 297)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.336)，2組基因型分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 HSA-LIT-7b多態(tài)性的基因型及其與非小細胞肺癌的關系

3 討論

在本研究中，我們嘗試鑒定NSCLC患者無細胞HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b mRNA的表達。在肺癌中，非小細胞肺癌占所有病例的80%～85%，超過70%的患者被診斷為晚期肺癌。實驗表明HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b參與腫瘤的形成和進展[13]。在乳腺癌、頭頸部和肺惡性腫瘤中，HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的過表達與預后和轉移密切相關。HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的過表達已被報道并與包括NSCLC在內的許多人類惡性腫瘤的發(fā)病機制有關[14]。

有研究者還分析了HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b在非小細胞肺癌中的表達與生存率降低有關[15]。本研究中，我們觀察到HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b基因的高表達與NSCLC患者的生存不良有關。我們觀察到不同時期的基因表達水平有顯著性差異。Ⅳ期、Ⅲ期和Ⅱ期患者的基因表達分別是Ⅰ期的4.5倍、3.63倍和1.73倍。當患者的總生存期較<13倍和>13倍的患者基因表達增加，發(fā)現基因表達>13倍的患者總生存率比<13倍的患者降低2.35倍。基因表達增加13倍以上的遠處轉移患者總生存率比基因表達增加<13倍的患者降低1.58倍。此外，基因表達增加13倍以上的非轉移患者總生存率降低1.28倍，遠處轉移患者基因表達增加13倍以上，總生存率下降2.53倍。在各種研究中，HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b在胰腺癌中的高表達率在30%～95%，HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的表達與局部晚期和轉移性疾病相關。在NSCLCs，尤其是腺癌中，HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b在70%的患者中過度表達。HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b在晚期非小細胞肺癌患者中高表達，與生存不良有關，HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的表達與肺癌的發(fā)病機制密切相關。有研究者在他的研究中指出HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b的表達水平可以作為NSCLC的預后和預測指標[16]。HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b被發(fā)現是一個轉移能力的區(qū)域，并被認為促進癌細胞的遷移和侵襲。它的表達已在多種人類惡性腫瘤中檢測到，包括高達50%～78%的乳腺癌[17]。據報道，HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7b在胃癌、乳腺癌等實體腫瘤中有較高的表達[18]。

在本研究中，我們認為無細胞HSA-miR30-5p和HSA-LIT-7bmRNA的表達可能是NSCLC患者整體生存和腫瘤惡性轉移行為的預測因素。