薛 夢(mèng)，孫亞蘭，黃 誠(chéng)

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.2017級(jí)碩士研究生；2.2018級(jí)碩士研究生；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4.疼痛醫(yī)學(xué)研究所，江西 贛州 341000)

疼痛是一種嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的病理生理性疾患，主要有急性痛和慢性痛[1]。神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic pain, NP)是慢性疼痛的一種，它是由中樞以及外周神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和功能障礙所引起的一種復(fù)雜性疾病[2]。緣由神經(jīng)病理性疼痛的病理生理學(xué)機(jī)制較為復(fù)雜且目前的治療效果不佳，因此，對(duì)其發(fā)病機(jī)制以及臨床治療的研究就顯得尤為迫切和重要。

針灸是祖國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，由針灸發(fā)展而來(lái)的電針(Electroacupuncture, EA)，因其不良反應(yīng)較小，在臨床上有較廣泛的應(yīng)用，比如，電針對(duì)慢性疼痛的治療作用已經(jīng)得到了全球的認(rèn)可[3-4]，但其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步闡明。特別值得一提的是，2019年世界衛(wèi)生組織(WHO)與世界針灸學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)(WFAS)建立了正式工作關(guān)系[5-7]，這預(yù)示著電針在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究將愈來(lái)愈受到關(guān)注。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，干擾素調(diào)節(jié)因子8(transcription factors interferon regulatory factor 8, IRF8)在背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion, DRG)上參與了2Hz電針對(duì)選擇性神經(jīng)損傷模型(Spared nerve injury, SNI)大鼠的鎮(zhèn)痛作用[8]。另有實(shí)驗(yàn)表明，IRF8通過(guò)影響脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄基因，激活小膠質(zhì)細(xì)胞[9]，形成中樞敏化，進(jìn)而導(dǎo)致慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展，但是關(guān)于IRF8是如何通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)影響中樞敏化的具體機(jī)制還不甚清楚[10-11]。在神經(jīng)病理性疼痛的狀態(tài)下，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)，BDNF/TrkB信號(hào)通路是形成中樞敏化的重要通路之一，并且已被大量實(shí)驗(yàn)證明其可通過(guò)N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDAR)參與中樞敏化[12-13]。另有研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)在神經(jīng)元可塑性中發(fā)揮重要作用[14]，mTOR可通過(guò)調(diào)控NMDAR參與神經(jīng)病理性疼痛的中樞敏化[15]?；诖?，我們提出假設(shè)：電針對(duì)IRF8與mTOR參與中樞敏化的調(diào)控作用是否與BDNF信號(hào)通路有一定的聯(lián)系。為此，本實(shí)驗(yàn)擬在SNI誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型上，探討鞘內(nèi)給予外源性BDNF后，其對(duì)2Hz電針作用于神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓IRF8和mTOR的表達(dá)影響，以期為電針進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療神經(jīng)病理性疼痛提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，體重180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[動(dòng)物中心許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002]，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物嚴(yán)格遵守贛南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組(n=4)：Sham組，SNI組，SNI+Mock EA組，SNI+EA組，SNI+EA+BDNF組和SNI+EA+PBS組。在SNI術(shù)后1天，分別對(duì)SNI+EA組，SNI+EA+BDNF組和SNI+EA+PBS組大鼠雙側(cè)的足三里和三陰交穴位進(jìn)行隔日電針治療14天，SNI+Mock EA組僅扎針不給予電刺激。Sham組暴露坐骨神經(jīng)不進(jìn)行結(jié)扎剪斷。所有大鼠在電針后的第14天取材。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器華佗牌一次性針灸針(0.28 mm×15 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司)，韓氏多功能電針儀(北京華運(yùn)安特科技有限公司)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自 invitrogen 公司(貨號(hào): C28025)，SYBR?Select Master Mix: Life technologies(貨號(hào):4368813)，IRF8和 mTOR 的特異性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3鞘內(nèi)置管及給藥方法麻醉后的大鼠俯臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，沿背部正中切開(kāi)皮膚，在L4/L5椎間隙處進(jìn)行穿刺，見(jiàn)大鼠尾巴甩動(dòng)進(jìn)行置管，PE-10導(dǎo)管置入約3.5 cm，將PE-10導(dǎo)管外端自皮下由頭頸部穿出，多點(diǎn)進(jìn)行固定。術(shù)畢動(dòng)物放回鋪有墊料的大鼠飼養(yǎng)籠，單籠飼養(yǎng)。觀察4～5天后，剔除置管不成功(癱瘓或跛行)，然后進(jìn)行神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型手術(shù)。在電針治療SNI大鼠后的第12天，連續(xù)鞘內(nèi)給予外源性的BDNF兩天，一天兩次，每次100 ng，每次間隔30 min。

1.4神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型制備參照文獻(xiàn)[16]介紹的方法建立SNI模型，大鼠用2%～3%濃度的異氟烷進(jìn)行麻醉。分離左側(cè)脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，保留腓腸神經(jīng)，用4號(hào)線(xiàn)分別結(jié)扎并剪斷脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，建立SNI大鼠模型，Sham組僅暴露脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，不進(jìn)行結(jié)扎剪斷，其他手術(shù)操作同前，麻醉蘇醒后將大鼠放回原籠。

1.5qPCR檢測(cè)電針后第14天，取L4～L6段脊髓組織置于1.5 mL的無(wú)酶的EP管，加入10倍體積的Trizol，用勻漿器充分將脊髓組織裂解，再加入1/5的氯仿，上下顛倒混勻15～30 s，室溫靜置5 min，4°，12 000×g，離心15 min。然后取上層水相，加入等體積異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，4°，12 000×g，離心10 min。加入75%的乙醇(用去RNA酶水配制)用于洗滌沉淀，洗滌后 4°，7 500×g，離心10 min，棄乙醇，進(jìn)行干燥。加20 μL的RNase Free 的水溶解，定量。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。qPCR反應(yīng)體系: cDNA 2 μL，1×SYBR 10 μL，加超純水至20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性20 min，PCR反應(yīng)，95 ℃變性10 s，61 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，共40個(gè)循環(huán)。各引物序列由上海生工生物公司合成，其引物序列如下(表1)。

表1 PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.12Hz電針對(duì)SNI模型大鼠脊髓IRF8和mTOR的mRNA表達(dá)的影響為觀察SNI模型大鼠脊髓IRF8和mTOR在2Hz電針的作用，我們?cè)诘?4天取材后，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)大鼠脊髓IRF8和mTOR的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與Sham組相比，SNI大鼠脊髓IRF8 的mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.05)；與SNI組相比，SNI+EA組大鼠脊髓IRF8的 mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)；與SNI組相比，SNI+Mock EA組大鼠脊髓IRF8的mRNA表達(dá)變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1A)。同樣，SNI大鼠脊髓mTOR的 mRNA表達(dá)顯著高于Sham組(P<0.01)；SNI+EA組大鼠脊髓mTOR 的mRNA表達(dá)明顯低于SNI組(P<0.05)；與SNI+EA組相比，SNI+Mock EA組大鼠脊髓中的mTOR mRNA表達(dá)變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖1B)。

圖1 2Hz EA對(duì)SNI模型大鼠脊髓IRF8和mTOR的 mRNA的影響

2.2鞘內(nèi)注射外源性BDNF對(duì)2Hz電針作用于大鼠脊髓IRF8和mTOR的mRNA表達(dá)影響為進(jìn)一步探討B(tài)DNF對(duì)2Hz電針作用于大鼠脊髓IRF8和mTOR 的表達(dá)影響，我們?cè)赟NI大鼠經(jīng)電針治療后的第12、13天分別鞘內(nèi)注射PBS和BDNF，每天2次，每次間隔半小時(shí)，注射劑量100 ng。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與PBS組相比，BDNF組大鼠脊髓中IRF8 mRNA的表達(dá)顯著升高(P<0.05)(見(jiàn)圖2A)。同樣的，BDNF組大鼠脊髓中mTOR mRNA的表達(dá)也明顯高于PBS組(P<0.05)(見(jiàn)圖2B)。

圖2. 鞘內(nèi)注射BDNF對(duì)脊髓IRF8和mTOR的mRNA的影響

3 討 論

神經(jīng)病理性疼痛因其中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的損傷病變而產(chǎn)生的機(jī)制比較復(fù)雜，導(dǎo)致其治療難度大，至今仍未有較好的治療方式。針灸在中國(guó)有著悠久且輝煌的臨床應(yīng)用歷史，由針灸發(fā)展而來(lái)的電針，因其可以通過(guò)刺激頻率、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化而更有利于開(kāi)展科學(xué)研究[5]。由于電針具有良好的鎮(zhèn)痛效果，在臨床上也得到了廣泛運(yùn)用，但目前有關(guān)電針治療神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制仍然不是很清楚。我們?cè)诩顾杷降膶?shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2Hz電針能夠顯著降低神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓IRF8和mTOR的基因表達(dá)，而B(niǎo)DNF可翻轉(zhuǎn)2Hz電針的這種作用，這提示BDNF參與了2Hz電針對(duì)SNI大鼠脊髓IRF8和mTOR的調(diào)控作用。

有研究報(bào)道IRF8也稱(chēng)為干擾素同源序列結(jié)合蛋白，是干擾素(IFNs)在多種細(xì)胞類(lèi)型中誘導(dǎo)的IRF轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一[17]。課題組前期結(jié)果顯示，IRF8在SNI大鼠模型的DRG有表達(dá)，并參與機(jī)械痛敏的形成[8]。有證據(jù)表明，IRF8在免疫細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞)以及外周神經(jīng)損傷(peripheral nerves injuries, PNI)后的免疫系統(tǒng)和脊髓均有表達(dá)[9]，而且IRF8在脊髓水平可通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展[18]。在PNI模型中，IRF8激活脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞后以p38依賴(lài)性方式釋放炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而形成中樞敏化[11]。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脊髓IRF8參與神經(jīng)病理性疼痛與小膠質(zhì)細(xì)胞P2X4受體的驅(qū)動(dòng)有著密切的關(guān)系[19-20]。這些研究都證實(shí)了IRF8可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和轉(zhuǎn)錄[9,21]，而活化的小膠質(zhì)細(xì)胞參與誘導(dǎo)中樞敏化并維持與小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的持續(xù)性疼痛[22-23]。BDNF已被證明在脊髓水平可誘發(fā)中樞敏化，是引發(fā)神經(jīng)病理性疼痛的重要信號(hào)通路之一[12-13]。而且脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活后可釋放BDNF，進(jìn)一步加強(qiáng)傷害性敏化[24]。Fang等[25]發(fā)現(xiàn)，在SNI模型中，脊髓IRF8可以通過(guò)下調(diào)BDNF來(lái)緩解神經(jīng)病理性疼痛。表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞中的IRF8和P2X4受體上調(diào)[26]，而且BDNF在小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)也上調(diào)，認(rèn)為這是導(dǎo)致中樞敏化和痛敏行為的一個(gè)關(guān)鍵因素。以上結(jié)果提示，IRF8在脊髓水平通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞誘發(fā)中樞敏化，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛，但引起中樞敏化的原因很可能與BDNF有關(guān)。

mTOR是細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的重要調(diào)節(jié)因子。有研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛模型中，mTOR在DRG的表達(dá)明顯上調(diào)，阻斷mTOR后可顯著提高模型大鼠的機(jī)械退縮閾值，進(jìn)而緩解疼痛[27]。在坐骨神經(jīng)慢性壓迫(Chronic constriction injury,CCI)模型中，脊髓的mTOR蛋白表達(dá)明顯升高，并誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛[28]。最近的證據(jù)表明，mTOR在脊髓參與突觸可塑性的變化，是調(diào)節(jié)傷害性敏化發(fā)展必不可少的因素[14,29]。在脊髓背角中，mTOR通路的激活參與了NMDAR觸發(fā)的中樞敏化[15]。在糖尿病所誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛狀態(tài)下，脊髓mTOR的激活介導(dǎo)了突觸蛋白Ⅱ和神經(jīng)突增生的上調(diào)[30]，兩者均可導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏，這進(jìn)一步說(shuō)明mTOR在神經(jīng)元可塑性中所發(fā)揮的作用，而且這可能與谷氨酸的過(guò)量釋放以及GABA能神經(jīng)元突觸傳遞有關(guān)。有實(shí)驗(yàn)表明，脊髓的BDNF-mTOR信號(hào)通路參與痛覺(jué)過(guò)敏[31]。在前扣帶回皮層，BDNF激活mTOR后上調(diào)NR2B可誘導(dǎo)炎性痛和厭惡情緒的產(chǎn)生[32]。以上研究證實(shí)，BDNF可通過(guò)激活mTOR參與脊髓可塑性并誘導(dǎo)中樞敏化，進(jìn)而產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛。

神經(jīng)病理性疼痛是一個(gè)世界性難題，因其復(fù)雜的病理機(jī)制及治療難度一直困擾著眾多患者。脊髓中樞敏化是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，BDNF信號(hào)所誘導(dǎo)GluN2B-NMDA受體觸發(fā)的中樞敏化已得到了認(rèn)可[12,33]，有關(guān)其上下游分子的作用仍有待于進(jìn)一步研究。有文獻(xiàn)報(bào)道，BDNF信號(hào)的上游分子IRF8和下游分子mTOR與中樞敏化有著重要的聯(lián)系，并且電針通過(guò)下調(diào)mTOR進(jìn)而抑制由脊髓損傷所引起的神經(jīng)病理性疼痛[34]。重要的是我們課題組前期的研究表明，電針可通過(guò)下調(diào)DRG的IRF8表達(dá)來(lái)緩解神經(jīng)病理性疼痛[8]。本實(shí)驗(yàn)探討了脊髓的IRF8和mTOR在2Hz電針對(duì)SNI誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的作用，我們發(fā)現(xiàn)SNI可明顯提高大鼠脊髓IRF8和mTOR的mRNA表達(dá)，而2Hz電針可顯著下調(diào)大鼠脊髓IRF8和mTOR的mRNA水平。為進(jìn)一步探索BDNF與中樞敏化的關(guān)系，在2Hz電針治療SNI誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠后，外源性給予BDNF，發(fā)現(xiàn)BDNF可明顯翻轉(zhuǎn)2Hz電針對(duì)SNI大鼠IRF8和mTOR的mRNA表達(dá)。我們的實(shí)驗(yàn)提示，在SNI誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型中，2Hz電針有可能通過(guò)下調(diào)SNI大鼠脊髓IRF8和mTOR的表達(dá)來(lái)抑制BDNF所誘導(dǎo)的中樞敏化。

綜上所述，2Hz電針鎮(zhèn)痛的脊髓機(jī)制有可能是通過(guò)下調(diào)IRF8和mTOR來(lái)抑制中樞敏化，并且BDNF參與這一過(guò)程，這將為電針治療神經(jīng)病理性疼痛提供一個(gè)新思路，即2Hz電針通過(guò)阻斷IRF8和mTOR的表達(dá)發(fā)揮對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的緩解作用。但本實(shí)驗(yàn)并未進(jìn)一步應(yīng)用IRF8、BDNF和mTOR的抑制劑去反向探討電針的作用機(jī)制，這有待于今后的研究加以闡明。