湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個(gè)果園黃龍病的巢式PCR檢測(cè)分析①

趙麗宏 劉建榮 張曼其 劉偉清 吳 凡 馮學(xué)娟

(廣東省湛江農(nóng)墾科學(xué)研究所 廣東湛江524086)

柑橘黃龍病（HLB）是柑橘生產(chǎn)上的毀滅性病害，是由一種革蘭氏陰性細(xì)菌引起的，最早是在廣東省潮汕地區(qū)被發(fā)現(xiàn)的。該病害主要發(fā)生在非洲、亞洲、美洲和大洋洲等50多個(gè)柑橘種植國(guó)家［1］。中國(guó)柑橘黃龍病主要發(fā)生在江西、云南、四川、福建、廣東等11個(gè)柑橘生產(chǎn)?。ㄊ?、自治區(qū)）［2］。該病害主要通過(guò)柑橘木虱、帶病的苗木、接穗等傳播，能侵染柑橘屬、枳屬、金柑屬和九里香等多種蕓香科植物［3-4］。由于黃龍病的病原菌是較難培養(yǎng)的細(xì)菌，因此分子水平上的研究一直無(wú)法深入開(kāi)展，直至2009年才獲得黃龍病亞洲種全基因組序列［5］。早期通過(guò)觀察植株典型癥狀來(lái)進(jìn)行黃龍病的田間形態(tài)學(xué)鑒定，具有一定的主觀性。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前主要采用PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)黃龍病的病原菌。Nested PCR是一種變異的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。程保平等［6］使用常規(guī)和巢式PCR 2種方法分別對(duì)同一樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)巢式PCR的檢測(cè)靈敏度大于常規(guī)PCR。

紅江橙是新會(huì)甜橙和福桔嫁接后形成的嵌合體植株，是一個(gè)早結(jié)、豐產(chǎn)、品質(zhì)良好的紅肉甜橙新品種［7］，同時(shí)也是湛江農(nóng)墾的特色和名優(yōu)產(chǎn)品。由于其果肉紅潤(rùn)、味道香濃、口感宜人，果皮薄滑、光亮，品質(zhì)上乘，成為中國(guó)出口創(chuàng)匯水果佳品［8］。紅江橙是紅江農(nóng)場(chǎng)科技人員在1971年發(fā)現(xiàn)并培育而成的變異單株，于1972年開(kāi)始選育種植，到1990年種植面積已達(dá)到1.33萬(wàn)hm2［9］。后來(lái)由于黃龍病的大面積發(fā)生，紅江橙種植面積下降至0.19萬(wàn)hm2，對(duì)湛江農(nóng)墾紅江橙產(chǎn)業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，直到2008年才開(kāi)始恢復(fù)種植［10］。柑橘黃龍病的發(fā)生，大幅降低了紅江橙的產(chǎn)量和品質(zhì)，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)會(huì)使整個(gè)果園絕收，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

針對(duì)柑橘黃龍病缺乏有效防治藥劑和抗病品種，目前主要采取以預(yù)防為主的方式來(lái)控制黃龍病的發(fā)生和蔓延［11］。因此，及時(shí)了解湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個(gè)果園黃龍病的發(fā)生情況，明確病害發(fā)生的原因，對(duì)于該病的有效防控具有重要的作用。2014年，黃勤知等［12］就已經(jīng)對(duì)紅江農(nóng)場(chǎng)的少部分果園進(jìn)行黃龍病的抽查，但這已是幾年前的事了，目前很有必要對(duì)湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)的果園進(jìn)行黃龍病發(fā)病率的抽查。2016～2018年，抽樣調(diào)查了湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個(gè)果園黃龍病的發(fā)生情況，對(duì)這2個(gè)果園紅江橙黃龍病進(jìn)行檢測(cè)分析，為今后該病的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

2016～2018年，在紅江農(nóng)場(chǎng)38隊(duì)紅江橙果園采集具有黃化、斑駁等癥狀的葉片樣本198個(gè)，于廣墾（湛江）紅江橙農(nóng)業(yè)科技有限公司橫江紅江橙果園采集具有上述相同癥狀的葉片樣本107個(gè)，共305個(gè)樣本。所采集的樣本按癥狀分類(lèi)、拍照和整理后，取其葉片，用液氮研磨至粉末狀，放-20℃保存待用。所用陽(yáng)性對(duì)照為經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的感病紅江橙葉片，陰性對(duì)照采自湛江農(nóng)墾科學(xué)研究所脫毒的紅江橙母本園。

1.2 引物

根據(jù)柑橘黃龍病病原亞洲株系16S rDNA設(shè)計(jì)Nested PCR引物［13］，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。其中nested PCR的外側(cè)引物為P2-1（5'-TGAATTCTTCGAGGTTGGTGAGC-3'）， P2-2（5'-AGAATTCGACTTAATCCCCACCT-3'）；內(nèi)側(cè)引物 P3-1（5'-GCGTTCATGTAGAAGTTGTG-3'），P3-2（5'-CCTACAGGTGGCTGACTCAT-3'）。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 葉片DNA的提取

用解剖刀切取靠近中脈的部分葉片組織，按照上海生工《植物基因組DNA提取試劑盒》的操作方法提取，提取的DNA置于-20℃冰箱備用。

1.3.2 Nested PCR檢測(cè)

以提取的紅江橙葉片總DNA為模板，反應(yīng)體系為20μL，進(jìn)行nested PCR擴(kuò)增。第一輪與第二輪的反應(yīng)體系一樣，其中包括10×PCR buffer（含Mg2+） 2 μL， 2.5 mmol/L each dNTP 1.6 μL，1μmol/L 引物各1 μL，5 U/μL Taq酶0.1 μL，模板DNA 1μL，H2O 13.3μL。使用引物P2-1/P2-2進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，然后取1μL第一輪PCR產(chǎn)物做第二輪PCR的模板，使用引物P3-1/P3-2進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 S，55℃退火40 S，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。最后進(jìn)行電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 部分樣本的PCR檢測(cè)結(jié)果

巢式PCR結(jié)果顯示，目的片段大小為400 bp。根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有無(wú)DNA特異擴(kuò)增條帶（400 bp）來(lái)判斷樣本中是否含有黃龍病的病原菌。若PCR為陽(yáng)性，說(shuō)明樣本中含有黃龍病的病原菌；若PCR為陰性，說(shuō)明樣本中沒(méi)有檢測(cè)出黃龍病的病原菌。圖1為2016年紅江農(nóng)場(chǎng)38隊(duì)部分紅江橙葉片樣本 的檢結(jié)果。

圖1 2016年紅江農(nóng)場(chǎng)38隊(duì)果園部分紅江橙葉片樣本PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 2016～2018年湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個(gè)果園黃龍病總的發(fā)生情況

305個(gè)葉片樣本黃龍病的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中可以看出，305個(gè)樣本中有162個(gè)樣本呈陽(yáng)性，黃龍?。℉LB）的檢出率為53.1%。其中紅江農(nóng)場(chǎng)果園HLB的陽(yáng)性檢出率較高，為55.6%。

表1 2016～2018年湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個(gè)果園黃龍病的檢測(cè)結(jié)果

2.3 不同單位紅江橙HLB的發(fā)生情況

從表2、表3中可看出，不同采樣地點(diǎn)、不同采樣時(shí)間黃龍病的陽(yáng)性檢出率存在一定的差異。從表2可看出，紅江農(nóng)場(chǎng)38隊(duì)紅江橙果園198個(gè)葉片樣本中有110個(gè)樣本呈陽(yáng)性，HLB的檢出率為55.6%。

表2 2016-2018年紅江農(nóng)場(chǎng)38隊(duì)紅江橙果園黃龍病的檢測(cè)結(jié)果

同時(shí)也可看出，紅江農(nóng)場(chǎng)38隊(duì)紅江橙果園HLB的陽(yáng)性檢出率逐年增加，2018年HLB的陽(yáng)性檢出率高達(dá)70.7%。

從表3可看出，廣墾（湛江）紅江橙農(nóng)業(yè)科技有限公司橫江紅江橙果園107個(gè)葉片樣本中有52個(gè)樣本呈陽(yáng)性，黃龍病的檢出率為48.6%；2017年黃龍病的陽(yáng)性檢出率最高，為56.7%，2018年黃龍病的陽(yáng)性檢出率較低，為42.9%。

表3 2016～2018年廣墾（湛江）紅江橙農(nóng)業(yè)科技有限公司橫江紅江橙果園黃龍病的檢測(cè)結(jié)果

造成該公司2018年黃龍病的陽(yáng)性檢出率低于往年的原因可能是由于柑橘黃龍病的病原菌主要寄生于柑橘的維管束細(xì)胞中，病原菌在柑橘體內(nèi)的含量較少、分布不均勻，使得所采集葉片中病原菌含量較少，造成PCR結(jié)果出現(xiàn)假陰性。

2.4 不同年份紅江橙HLB的發(fā)生情況

2016～2018年湛江農(nóng)墾紅江農(nóng)場(chǎng)38隊(duì)紅江橙果園和廣墾（湛江）紅江橙農(nóng)業(yè)科技有限公司橫江紅江橙果園均有不同程度的黃龍病發(fā)生，且陽(yáng)性檢出率逐年增加，2018年黃龍病的陽(yáng)性檢出率高達(dá)62.4%。具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4～6。

表4 2016年湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個(gè)果園黃龍病的檢測(cè)結(jié)果

表5 2017年湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個(gè)果園黃龍病的檢測(cè)結(jié)果

表6 2018年湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個(gè)果園黃龍病的檢測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

柑橘黃龍病（HLB）是一種細(xì)菌性病害，潛伏期長(zhǎng)，且病原菌在柑橘組織中分布不均勻，這給黃龍病的早期檢測(cè)及防控帶來(lái)了困難［14-15］。加強(qiáng)柑橘黃龍病的檢測(cè)是預(yù)防黃龍病發(fā)生的基礎(chǔ)［16］，黃龍病可防控，但不可治療，這就需要加強(qiáng)該病害的早期檢測(cè)。因此，采用快速、準(zhǔn)確、適用于大批量樣本的檢測(cè)技術(shù)對(duì)柑橘果園進(jìn)行定期的監(jiān)測(cè)，對(duì)防治該病害的傳播蔓延具有極其重要的作用。

本研究明確了柑橘黃龍病在湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個(gè)果園中的分布及危害情況，為有效防控黃龍病提供科學(xué)依據(jù)。2016～2018年，筆者對(duì)這2個(gè)果園的紅江橙葉片樣本進(jìn)行黃龍病的系統(tǒng)調(diào)查，采用nested PCR技術(shù)對(duì)具有黃化、斑駁等癥狀的305個(gè)葉片樣本進(jìn)行黃龍病的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，305個(gè)樣本中有162個(gè)樣本呈陽(yáng)性，黃龍病的檢出率為53.1%。紅江農(nóng)場(chǎng)38隊(duì)紅江橙果園黃龍病的陽(yáng)性檢出率為55.6%，且該果園黃龍病的陽(yáng)性檢出率逐年增加，這一研究與黃勤知等［12］的研究是一致的；廣墾（湛江）紅江橙農(nóng)業(yè)科技有限公司黃龍病的陽(yáng)性檢出率也很高，達(dá)到了48.6%，這說(shuō)明黃龍病已在湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)的這2個(gè)果園普遍發(fā)生且危害較嚴(yán)重，同時(shí)也表明，按照黃龍病的典型癥狀如斑駁、黃化等進(jìn)行采樣，陽(yáng)性檢出率也很高。由于柑橘黃龍病是一種韌皮部革蘭氏陰性細(xì)菌，在柑橘組織中分布不均勻且含量較低［17］，采樣的差異也可能會(huì)使小部分材料出現(xiàn)假陰性。因此，采樣時(shí)要盡量選取有明顯癥狀的植株，從植株的不同方位（即東西南北中5個(gè)方位）均勻選取葉片進(jìn)行檢測(cè)，以減少假陰性的出現(xiàn)［6］。此次對(duì)湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個(gè)果園的普查發(fā)現(xiàn)，個(gè)別樣本有典型的斑駁、黃化癥狀，但檢測(cè)結(jié)果為陰性，是否與樣本的采集有關(guān)有待進(jìn)一步的證實(shí)。

通過(guò)對(duì)湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)2個(gè)果園具有黃化、斑駁等癥狀的紅江橙葉片樣本進(jìn)行檢測(cè)，確定這2個(gè)果園出現(xiàn)的黃化、斑駁等癥狀是由黃龍病的病原菌引起的。程保平等［6］通過(guò)對(duì)柑橘多個(gè)品種和多個(gè)部位中黃龍病菌的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，失管果園是黃龍病傳播的源頭，黃龍病可能借助媒介昆蟲(chóng)-柑橘木虱傳播到健康植株上。經(jīng)調(diào)查可知，湛江農(nóng)墾紅江橙主產(chǎn)區(qū)這2個(gè)果園的水肥、除草等田間管理水平相差不大，不同之處在于紅江農(nóng)場(chǎng)38隊(duì)果園周?chē)泻芏噢r(nóng)戶(hù)種植紅江橙，且這些紅江橙大多處于失管狀態(tài)，雜草叢生，植株大都表現(xiàn)出黃化、斑駁等癥狀。黃龍病的平均檢出率為53.1%，說(shuō)明紅江橙受黃龍病的危害較嚴(yán)重。廣墾（湛江）農(nóng)業(yè)科技有限公司橫江果園周?chē)挥猩倭康霓r(nóng)戶(hù)種植紅江橙，黃龍病的平均檢出率為48.6%，相對(duì)于紅江農(nóng)場(chǎng)38隊(duì)果園來(lái)說(shuō)發(fā)病率較低。這些現(xiàn)象說(shuō)明果園周?chē)Ч芸赡軙?huì)導(dǎo)致蟲(chóng)媒——柑橘木虱進(jìn)入果園，危害該果園的紅江橙。因此不僅要加強(qiáng)對(duì)果園的水肥、除草等田間管理，還要加強(qiáng)種苗的檢測(cè)，以減少黃龍病對(duì)紅江橙的危害。

綜上所述，建議加強(qiáng)紅江橙種苗黃龍病的檢測(cè)檢疫以及果園的栽培管理，及時(shí)挖除感病植株，同時(shí)可補(bǔ)種無(wú)病的紅江橙大苗，預(yù)防柑橘木虱，堅(jiān)持“預(yù)防為主、綜合防治”的原則，采取防病與防蟲(chóng)相結(jié)合，化學(xué)藥劑與生物防治相結(jié)合的方法，增施有機(jī)肥或特種肥，結(jié)合修剪控梢增強(qiáng)樹(shù)勢(shì)，減少木虱的數(shù)量，杜絕病害的持續(xù)蔓延。