李夢(mèng)嵐 譚琴 徐秀

1武漢市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科 430000; 2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430000

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是由糖尿病引起的腎臟微血管病變。研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞損傷是DN的主要發(fā)病機(jī)制，主要包括足細(xì)胞肥大、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、足細(xì)胞脫落和凋亡等。腎病蛋白(nephrin)是足細(xì)胞成熟的標(biāo)志性分子，具有維持足細(xì)胞完整和腎小球?yàn)V過(guò)功能的作用。研究表明，在各種蛋白尿性腎臟疾病以及腎小球疾病的動(dòng)物模型中，腎病蛋白的表達(dá)降低，且腎病蛋白的低表達(dá)與足細(xì)胞損傷及腎臟疾病的進(jìn)展有關(guān)。微小RNA(microRNA，miRNA)作為小分子非編碼RNA可通過(guò)抑制或降解靶基因mRNA，參與生物體的多種生理及病理過(guò)程。在DN患者的腎組織中可見特異性miRNA的表達(dá)，其在一定程度上可反映患者病情的改變。最近研究表明，miRNA-192在腎臟病理生理過(guò)程中起關(guān)鍵作用，miRNA-192的表達(dá)與DN有關(guān)。Wilms腫瘤蛋白1(WT1)是Wilms瘤抑癌基因，在腎組織中特異性表達(dá)于足細(xì)胞，是足細(xì)胞的標(biāo)志蛋白。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞并檢測(cè)miRNA-192及WT1的表達(dá)水平，探討二者在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制，為臨床治療DN提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑 人腎小球足細(xì)胞(human podocyte cell，HPC)、葡萄糖(均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、Lipofectamine 2000[購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]、miRNA-192抑制劑及其陰性對(duì)照(均購(gòu)自上海吉瑪生物科技公司)、Trizol、miRNA-192、U6引物(Invitrogen公司)、WT1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、GAPDH普通PCR上下游引物(上海生工公司)、WT1兔單克隆抗體(ab224806)、腎病蛋白兔單克隆抗體(ab227806)、TGF-β1小鼠單克隆抗體(ab190503)、α-SMA兔單克隆抗體(ab32575)、β-actin兔單克隆抗體(ab179467，美國(guó)Abcam公司)、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司)。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 足細(xì)胞復(fù)蘇后在含10%胎牛血清及5.5 mmo1/L葡萄糖的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于33℃、5% CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 d換1次液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至細(xì)胞融合80%時(shí)用含0.05%胰蛋白酶的消化液進(jìn)行消化傳代，然后轉(zhuǎn)入37℃、5% CO培養(yǎng)箱分化14 d。選取在37℃條件下分化為樹枝狀的HPC為研究對(duì)象，并將細(xì)胞分為4組：A組為空白對(duì)照組：細(xì)胞正常培養(yǎng)(5.5 mmo1/L葡萄糖)，不做處理；B組為高糖組：在細(xì)胞中加入30 mmol/L葡萄糖；C組為陰性對(duì)照組：在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L的miRNA NC，轉(zhuǎn)染6 h后加入30 mmol/L葡萄糖進(jìn)行培養(yǎng)；D組為miRNA-192抑制組：在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L的miRNA-192 Inhibitor，轉(zhuǎn)染6 h后加入30 mmol/L葡萄糖進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 采用Western印跡檢測(cè)各組足細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白腎病蛋白、WT1、TGF-β1、α-SMA的蛋白表達(dá)水平 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞提取總蛋白，取40 μg與上樣緩沖液混合，100℃加熱5 min后通過(guò)10% SDS-PAGE電泳分離，90 V電壓轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜后加入腎病蛋白、WT1、TGF-β1、α-SMA一抗4℃過(guò)夜，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，用化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。以β-actin為內(nèi)參，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miRNA-192、WT1、TGF-β1、α-SMA mRNA表達(dá)水平 取各組細(xì)胞分別加入1 ml Trizol，混合均勻后冰上裂解5 min，12 000 g離心15 min；取上清加入200 μl氯仿，充分混勻后冰上靜置10 min，12 000 g離心10 min；棄上清，加入75%乙醇7 500 g離心5 min，室溫晾干，加入DEPC水溶解。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，取1 μl cDNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)后72℃延伸10 min。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。miRNA-192上游引物：5′-CGCGGCTGACCTATGAATTG-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。每組基因的相對(duì)表達(dá)量按公式(2法)計(jì)算。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 qRT-PCR檢測(cè)各基因引物序列

1.2.3 miRNA-192與WT1基因的靶向關(guān)系 采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miRNA-192與WT1基因的靶向關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分別擴(kuò)增出含miRNA-192結(jié)合位點(diǎn)的WT1 3′UTR序列(tcTTGTCTAACATTCCCGAGGTCAg)及miRNA-192結(jié)合位點(diǎn)突變的WT1 3′UTR序列(tcTTTTCTAACAGTCCCGGTTCCAg)，將其插入到熒光素酶報(bào)告基因載體(psiCHECK2)上，構(gòu)建野生型WT1-Wt和突變型WT1-Mut重組質(zhì)粒。根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照1 μg重組質(zhì)粒，2 μl Lipofectamine 2000比例稀釋后，將其與Lipofectamine 2000混合液分別與miRNA-192抑制劑及陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至足細(xì)胞中，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h后更換為新鮮的、含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，收集并裂解細(xì)胞，12 000 g離心5 min，取上清用于測(cè)定，按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞腎病蛋白的蛋白表達(dá)水平 與A組相比，B組和C組腎病蛋白的蛋白表達(dá)水平顯著降低(=444.404，<0.05)；與C組相比，D組腎病蛋白的蛋白表達(dá)水平升高(=16.519，<0.05)，見圖1。

2.2 各組細(xì)胞miRNA-192的相對(duì)表達(dá)量 與A組相比，B組和C組miRNA-192相對(duì)表達(dá)量顯著升高(=184.216，<0.05)；與C組相比，D組miRNA-192相對(duì)表達(dá)量降低(=10.533，<0.05)，見圖2。

2.3 各組細(xì)胞WT1蛋白及mRNA的表達(dá)水平 與A組相比，B組和C組WT1蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著降低(=243.543，<0.05；=107.898，<0.05)；與C組相比，D組WT1蛋白及mRNA表達(dá)水平升高(=17.088，<0.05；=8.186，<0.05)，見圖3。

2.4 miRNA-192與WT1基因的靶向關(guān)系驗(yàn)證 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析結(jié)果顯示，miRNA-192與WT1基因3′-UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，miRNA-192與WT1能夠靶向結(jié)合。熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，抑制miRNA-192后可明顯促進(jìn)熒光素酶活性；而將WT1的3′-UTR突變后，熒光素酶活性無(wú)變化，見圖4。

2.5 各組細(xì)胞TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)水平 與A組相比，B組、C組TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著升高(=69.014，<0.05；=87.644，<0.05；=147.714，<0.05；=247.584，<0.05)；與C組相比，D組TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA蛋白表達(dá)水平均降低(=6.114，<0.05；=7.941，<0.05；=8.239，<0.05；=8.481，<0.05)，見圖5。

3 討論

DN是造成終末期腎功能衰竭最普遍的原因，也是主要的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，是全世界腎臟病患者發(fā)病和死亡的主要原因。足細(xì)胞是一種高度分化的腎小球上皮細(xì)胞，其形態(tài)及功能異常是DN白蛋白尿產(chǎn)生及腎小球纖維化的重要原因之一。研究表明，miRNA在DN的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。miRNA-192是在腎臟組織中尤其是系膜細(xì)胞中特異性表達(dá)的miRNA，可調(diào)控系膜細(xì)胞的增殖和凋亡并促進(jìn)腎纖維化，與DN的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。陳月英等研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-192水平在DN患者尿液中表達(dá)顯著升高，且與腎功能損傷程度相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠腎皮質(zhì)中miRNA-192的表達(dá)增加，用體內(nèi)缺乏miRNA-192基因的小鼠建立糖尿病模型后，腎組織纖維化及肥大程度減輕，白蛋白尿排泄率下降。本研究采用高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與A組相比，B組和C組腎病蛋白的蛋白表達(dá)水平顯著降低，而miRNA-192相對(duì)表達(dá)量升高；與C組相比，D組腎病蛋白的蛋白表達(dá)水平升高、miRNA-192相對(duì)表達(dá)量降低。提示高糖可導(dǎo)致足細(xì)胞miRNA-192表達(dá)水平升高，足細(xì)胞功能損傷；抑制miRNA-192表達(dá)后可減輕足細(xì)胞損傷。

miRNAs是一類可對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的分子，其可通過(guò)下游靶點(diǎn)對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及凋亡等生理過(guò)程的調(diào)控起重要作用。WT1是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與足細(xì)胞分化并維持足細(xì)胞的功能，其在成熟足細(xì)胞中高度表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，腎小球硬化小鼠的成熟足細(xì)胞中WT1基因表達(dá)顯著降低。高原等研究發(fā)現(xiàn)，IgA腎病患者腎組織WT1表達(dá)降低，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，加重腎間質(zhì)纖維化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞中WT1基因表達(dá)降低，與C組相比，D組WT1蛋白表達(dá)水平及mRNA表達(dá)水平升高；進(jìn)一步對(duì)miRNA-192與WT1基因的靶向關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-192與WT1基因3′-UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，miRNA-192與WT1能夠靶向結(jié)合。提示miRNA-192可能通過(guò)靶向調(diào)控WT1，在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，損傷的腎小管上皮細(xì)胞誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞積累，并通過(guò)EMT最終導(dǎo)致小管間質(zhì)纖維化和慢性腎臟疾病的進(jìn)展。DN時(shí)足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化僅有EMT相關(guān)表型蛋白的表達(dá)變化，主要表現(xiàn)為上皮表型蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白1、腎病蛋白等表達(dá)逐漸缺失，同時(shí)間質(zhì)表型蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶-9、TGF-β1及α-SMA等表達(dá)增加。在DN小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，腎小球miRNA-192的表達(dá)增加與TGF-β活性增強(qiáng)有關(guān)，對(duì)腎臟miRNA-192的特異性抑制作用可降低腎組織纖維化并抑制白蛋白尿反應(yīng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與A組相比，B組和C組TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著升高；與C組相比，D組TGF-β1、α-SMA蛋白及mRNA蛋白表達(dá)水平均降低，提示高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)DN的發(fā)展；抑制miRNA-192的表達(dá)可減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT。

綜上所述，高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞miRNA-192表達(dá)升高并靶向調(diào)控WT1促進(jìn)DN的發(fā)展，其作用機(jī)制可能與足細(xì)胞EMT有關(guān)；抑制miRNA-192的表達(dá)可減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞EMT，為今后DN的預(yù)防和治療提供新思路。但miRNA-192是否通過(guò)靶向WT1促進(jìn)足細(xì)胞EMT，有待進(jìn)一步研究。