董貴俊，閆 前，吳 燕，田雪文，李可峰

（山東體育學(xué)院，山東 濟(jì)南250102）

0 前言

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）影響全球3 億人口生活質(zhì)量，其發(fā)病率以每年高達(dá)33.5%的增長率快速升高，預(yù)計2020年，其發(fā)病率將升為全球第4（GBD 2017 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators.，2018）。關(guān)節(jié)疼痛和僵硬是OA 的主要癥狀，主要病理學(xué)特征是進(jìn)行性關(guān)節(jié)退化伴軟骨損失，異常重塑和糜爛，關(guān)節(jié)邊緣處形成骨贅，肌肉及韌帶退化等（Li et al.，2013）；除導(dǎo)致慢性疼痛和運動障礙等之外，副作用還包括誘發(fā)心理疾病，增加患肥胖和心血管疾病的風(fēng)險等，從而影響患者壽命及生活質(zhì)量（Sarzi-Puttini et al.，2005）。OA 的發(fā)病原因較為復(fù)雜，與年齡、肥胖、缺乏運動、遺傳易感性、性別差異、創(chuàng)傷等諸多因素相關(guān)（Heidari，2011）。

OA 臨床治療主要以藥物治療、物理治療等手段來緩解患者疼痛、延緩病程進(jìn)展、保護(hù)關(guān)節(jié)功能、改善患者生活質(zhì)量，但效果并不理想（Hochberg et al.，2001）。近年來，運動療法逐漸被臨床應(yīng)用并取得出乎意料的預(yù)防和治療效果（劉洋 等，2018；Brismée，2014），因此運動療法已經(jīng)成為近年來研究OA 的新熱點。OA 的病發(fā)機(jī)理并未隨著多年的實驗研究而被揭開，如何結(jié)合新的科學(xué)技術(shù)手段盡快找到其病發(fā)機(jī)理和新型治療手段是關(guān)乎OA 預(yù)防及治療的關(guān)鍵。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是一種能自我更新的干細(xì)胞，并在誘導(dǎo)下進(jìn)行多譜系的分化，能夠分化、成熟形成為骨、軟骨、脂肪等器官或組織（Bianco et al.，2014），而間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體（MSCs-Exosome，MSCs-Exo）有相同的功能，并具有性質(zhì)穩(wěn)定、方便保存、利于提取且容易改造等的應(yīng)用優(yōu)勢，逐漸成為治療骨關(guān)節(jié)炎的新的研究方向。本文就MSCs-Exo 對骨關(guān)節(jié)炎的修復(fù)作用進(jìn)行探討，并闡述運動與二者的調(diào)節(jié)關(guān)系。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞及其來源的外泌體

MSCs 具有多譜系分化潛能，能夠自我更新并分化成譜系細(xì)胞（如肌肉、骨骼、脂肪和軟骨等）及非譜系的細(xì)胞（如神經(jīng)元細(xì)胞等）。再生醫(yī)學(xué)研究證實，臨床治療疾病時MSCs 在48 h 內(nèi)會迅速從體內(nèi)清除（Timmers et al.，2007）；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 治療過程中通過細(xì)胞分化直接對組織修復(fù)的作用最?。ˋslam et al.，2009），而旁分泌、免疫調(diào)節(jié)途徑是其體內(nèi)治療的主要機(jī)制（Cheng et al.，2013）。因此，MSCs 的穩(wěn)定性和生物學(xué)效應(yīng)是影響其臨床效用的關(guān)鍵要素。近期，一種幾乎所有細(xì)胞類型都可釋放和胞吞的細(xì)胞外囊泡——外泌體（Théry et al.，2009）受到人們越來越多的關(guān)注。外泌體（exosomes）是直徑為30～100 nm，由磷脂雙分子層包裹的微囊泡，其內(nèi)含有大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及DNA、mRNA、微小RNA（miRNA）和非編碼RNA 形式的核酸材料（Théry et al.，2009）。外泌體始于早期內(nèi)吞體的出現(xiàn)，即膜表面內(nèi)吞形成的內(nèi)吞體，其在高爾基體作用下成熟發(fā)育為晚期內(nèi)吞體，并向內(nèi)出芽，形成包裹來自高爾基體的蛋白質(zhì)、DNA、mRNA 和miRNA的腔內(nèi)囊泡組成的多胞體（multivesicular body，MVB）（Théry et al.，2002；Trams et al.，1981）。最后，MVB 與質(zhì)膜融合，將外泌體通過胞吐作用釋放，或?qū)⑵渌椭寥苊阁w進(jìn)行降解。外泌體從細(xì)胞內(nèi)被釋放后，與相鄰細(xì)胞或遠(yuǎn)處細(xì)胞通過內(nèi)分泌和旁分泌的方式進(jìn)行信號傳遞。信號的傳遞方式一般分為3 種：1）外泌體直接作用于細(xì)胞膜；2）與細(xì)胞表面受體相結(jié)合；3）通過內(nèi)吞作用傳遞等多種途徑（圖1）。因此，外泌體既可作為重要的信號傳遞信使和載體，將信號傳遞給相應(yīng)的靶細(xì)胞，改變它們原有的生理功能和狀態(tài)；也可作為細(xì)胞排泄的主要途徑，以解決未利用或有害的RNA 和蛋白質(zhì)（Raposo et al.，2004）。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)將MSCs-Exo 注入軟骨損傷處，可見其狀態(tài)穩(wěn)定并對軟骨有修復(fù)作用，因此，一旦其表征和生物學(xué)得到進(jìn)一步的認(rèn)知，其將具有臨床治療應(yīng)用潛力（Zhang et al.，2016b）。

圖1 外泌體的形成及分泌蛋白質(zhì)和RNA及作用于靶細(xì)胞（修改自Raposo et al.，2013）Figure 1.Exosome Formation and Secretion of Proteins and RNA and their Effects on Target Cells

外泌體內(nèi)含有mRNA、miRNA、tRNA 這些調(diào)節(jié)受體細(xì)胞活動的主要RNA（Ana et al.，2016）。其中，miRNA 是細(xì)胞間信息交互的主要物質(zhì)，利用其自體的降解和再表達(dá)來調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的基因表達(dá)。細(xì)胞中RNA 的表達(dá)并不具有供體和組織特異性等表達(dá)特性，但外泌體中所含的RNA 卻較大水平上受細(xì)胞的具體類型和分化的影響。MSCs-Exo 來源于不同的組織也具備不同的功能，其所含的RNA 或蛋白能夠發(fā)揮其細(xì)胞應(yīng)有的作用并調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化，可以避免損傷，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)以及促進(jìn)細(xì)胞損傷后的自我修復(fù)和組織重建（Liang et al.，2013；Lopez-Verrilli et al.，2016）。

2 MSCs分泌作用與軟骨損傷修復(fù)的關(guān)系

MSCs 可以直接分泌營養(yǎng)因子，也具有旁分泌作用，兩種機(jī)制協(xié)同作用改善組織器官局部微環(huán)境，促進(jìn)組織修復(fù)。Wu 等（2011）通過將人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和人（或者牛）的原代軟骨細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSCs 會促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）的營養(yǎng)作用，促進(jìn)了軟骨的形成，表明共培養(yǎng)過程中MSCs營養(yǎng)分泌促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生長。其后，Wu 等（2012）從脂肪、滑膜組織中分離出MSCs，將其進(jìn)行相同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)軟骨基質(zhì)同樣增加，證實了對于軟骨細(xì)胞，MSCs 的營養(yǎng)作用與來源無關(guān)，是一種普遍現(xiàn)象。另一方面，MSCs 會借助旁分泌機(jī)制，調(diào)控抗炎和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制來改善再生環(huán)境修復(fù)損傷（Murphy et al.，2013）。研究表明，人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，hAd-MSCs）可用于發(fā)炎或受損組織的再生。為了鑒定發(fā)炎期間hAd-MSCs 分泌的蛋白，將hAd-MSCs 暴露于腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）的環(huán)境之中。在TNF-α 環(huán)境誘導(dǎo)下，118 種蛋白質(zhì)得以更高水平分泌，包括多種細(xì)胞因子和趨化因子，如白介素-6（IL-6）、IL-8、趨化因子（C-X-C 基序）配體6 和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等。這些因子釋放降低了炎癥反應(yīng)，改善了局部環(huán)境（Lee et al.，2010）。此外，旁分泌機(jī)制也是MSCs 發(fā)揮其功能必不可少的一個環(huán)節(jié)。關(guān)節(jié)表面會在注射MSCs 后得到相應(yīng)的修復(fù)，MSCs 從中協(xié)調(diào)和增強(qiáng)了修復(fù)應(yīng)答，其自身的細(xì)胞才是修復(fù)損傷的主要細(xì)胞（Barry et al.，2013）。大鼠實驗發(fā)現(xiàn)，MSCs 作為干細(xì)胞的修復(fù)作用體現(xiàn)在改變細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑，上調(diào)Ihh 以及BMP-2 的表達(dá)，促進(jìn)Ⅱ型膠原蛋白分泌增加，進(jìn)而改善軟骨損傷（Horie et al.，2012）。MSCs-Exo 內(nèi)富含有大量的miRNA（Sheng et al.，2010），通過其特有的分泌功能，使miRNA 更好的發(fā)揮調(diào)控多種重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。miRNA 是一些單鏈非編碼RNA 小分子，由19～25 個核苷酸構(gòu)成，通過與互補的mRNA 結(jié)合來調(diào)節(jié)細(xì)胞中許多蛋白質(zhì)的產(chǎn)生（He et al.，2004）。miRNA 參與細(xì)胞的許多進(jìn)程，包括發(fā)育、分化、增殖、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、脂肪代謝和胰島素分泌（Ambros et al.，2004），且在控制干細(xì)胞的分裂過程中起著重要功效（Hatfield et al.，2005）。miRNA 可以影響炎癥反應(yīng)的發(fā)展過程，如抑制致炎相關(guān)的靶基因，減少靶基因的蛋白產(chǎn)物的生成（Wijnhoven et al.，2007）。這些miRNA 在介導(dǎo)OA 在內(nèi)的一些損傷和相關(guān)疾病中產(chǎn)生關(guān)鍵作用。軟骨發(fā)育和體內(nèi)環(huán)境的平衡受MSCs 分泌的microRNA-320（miR-320）的影響，miR-320 直接靶向基質(zhì)金屬蛋白酶-13（Matrix metalloproteinase-13，MMP-13）并下調(diào)其表達(dá)，降低IL-1β 對軟骨的刺激，來調(diào)節(jié)小鼠軟骨細(xì)胞的分解代謝，保護(hù)小鼠軟骨（Meng et al.，2016）。MicroRNA-92a（miR-92a）的直接靶標(biāo)是Bmp 拮抗劑基因noggin3（nog3），mir92a 的失活會使nog3 mRNA 的穩(wěn)定性增加，抑制Bmp 信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致軟骨前體細(xì)胞不能正常增殖、分化（Ning et al.，2013）。miR-125b 在正常人群和OA 患者的軟骨細(xì)胞中均表達(dá)，但在OA 患者軟骨細(xì)胞中的表達(dá)明顯不及正常人群。此外，IL-1β 誘導(dǎo)的ADAMTS-4 上調(diào)可以被人體OA 軟骨細(xì)胞中miR-125b 的過表達(dá)所抑制（Matsukawa et al.，2013）。在微團(tuán)培養(yǎng)中，人類脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在ATDC5 細(xì)胞誘導(dǎo)軟骨形成的過程中會分泌miR-92a 參與并促進(jìn)軟骨形成（Hou et al.，2015）。

3 MSCs免疫調(diào)節(jié)與OA預(yù)防

機(jī)體促炎細(xì)胞因子的快速上調(diào)會導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)損害，如何調(diào)節(jié)受損軟骨或OA 中的炎癥環(huán)境是軟骨治療中的重要一環(huán)（Utomo et al.，2016）。MSCs 通過旁分泌的細(xì)胞因子來調(diào)控細(xì)胞的免疫功能，發(fā)揮其免疫潛能（Marigo et al.，2011），如干擾素γ（Interferon-γ，IFNγ）（Kang et al.，2005）、轉(zhuǎn)化生長因子β 1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）（Liu et al.，2012）、白介素6（Interleukin 6，IL-6）（Djouad et al.，2007）等，通過介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)，降低炎癥因子的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在MSCs 移植修復(fù)受損組織的情況下，IFN-γ 對CTL 反應(yīng)起促進(jìn)作用，保護(hù)宿主免受病毒攻擊，從而保護(hù)其免受免疫抑制作用（Kang et al.，2005）。MSCs也可以通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1和誘導(dǎo)IL-10 的高表達(dá)來表現(xiàn)出強(qiáng)大的免疫抑制作用，且分泌抗炎因子TGF-β1的水平在延長培養(yǎng)過程中保持不變（Liu et al.，2012）。另一方面，MSCs 會通過IL-6 的分泌來減少促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，從而達(dá)到免疫調(diào)節(jié)作用（Djouad et al.，2007）。可以看出，MSCs 的免疫調(diào)節(jié)活性需要多種細(xì)胞因子共同作用產(chǎn)生（Ghannam et al.，2010；Kang et al.，2005；Liu et al.，2012）。MSCs-Exo 同樣可以誘導(dǎo)IL-10 和TGF-β1的高表達(dá)，降低IL-1、IL-6、TNF-α 的表達(dá)，來減少炎癥反應(yīng)以保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。MSCs-Exo 在異體皮膚移植小鼠中會產(chǎn)生主動免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞，但未移植的小鼠中并未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，表明MSCs-Exo 具有免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制的作用（Zhang et al.，2014）。長期炎癥環(huán)境的特征是輔助性T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的持續(xù)失衡（Grivennikov et al.，2010）。MSCs 通過調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DCs）、效應(yīng)T 細(xì)胞（TH1 和TH2）、自然殺傷細(xì)胞（NK）等來減少IFN-γ 的表達(dá)和增加IL 的分泌；另一方面，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hBMSCs）會促使DC1 成熟從而降 低TNF-α 分泌，促進(jìn)DC2 成熟從 而 增 加IL-10分泌，間接促使TH1 向TH2 細(xì)胞轉(zhuǎn)變，隨著IL-4 和IL-10 的表達(dá)增強(qiáng)，恢復(fù)了TH1/TH2 平衡，減輕了自身免疫性疾病的癥狀（Aggarwal，2005；Parekkadan et al.，2010）。同樣，IFN-γ的表達(dá)被抑制后，隨著IL-4 分泌會誘使巨噬細(xì)胞從M1 型（促炎，抗血管生成和組織生長抑制）轉(zhuǎn)變?yōu)镸2 型（抗炎，促重組和組織愈合），從而促進(jìn)骨髓、肌肉和神經(jīng)的愈合和再生（Tidball et al.，2010）。MSCs 通過影響免疫細(xì)胞的分泌能力來調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)機(jī)制。實驗印證MSCs-Exo對T 細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用時發(fā)現(xiàn)，MSCs-Exo 具有和MSCs相同的功能，可以減少IFN-γ 和TNF-α 的分泌，增加IL-4、IL-10 和TGF-β 的產(chǎn)生；當(dāng)與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)時，MSCs 通過增強(qiáng)前列腺素E2 的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)（Blazquez et al.，2014；Zhang et al.，2014）。另外，MSCs-Exo 抑制自身免疫性淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)（Mokarizadeh et al.，2012；Zhang et al.，2014）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MSCs-Exo 不直接對T 淋巴細(xì)胞起免疫抑制作用，而是通過巨噬細(xì)胞與MSCs-Exo 的相互作用后，巨噬細(xì)胞被誘導(dǎo)為分泌抗炎細(xì)胞因子的M2 樣表型，并為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群提供生存環(huán)境（Zhang et al.，2014）。

4 MSCs對骨損失的修復(fù)作用

伴隨著OA 病情的進(jìn)展，逐漸壞死脫落的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞導(dǎo)致潮線向軟骨層推進(jìn)，破裂崩壞，引發(fā)囊腔樣空洞的產(chǎn)生（Bonde et al.，2015）。MSCs 具備成骨能力，通過對骨和軟骨受損組織進(jìn)行修復(fù)和再生來改善膝骨性關(guān)節(jié)炎。體內(nèi)外泌體分泌水平較低的CD92/2 小鼠，其股骨骨折后愈合能力較野生型小鼠顯著下降；隨后將從MSCs 培養(yǎng)基中分離的外泌體注射入CD92/2 小鼠骨折處，能顯著促進(jìn)骨折愈合，并誘導(dǎo)血管的生成（Furuta et al.，2016）。此外，臨床上將源自人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體（Exosomes derived from human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells，hiPS-MSC Exos）與β-磷酸三鈣（β-Tricalcium phosphate，β-TCP）聯(lián)合應(yīng)用，促進(jìn)了小鼠顱骨缺損處的骨再生（Zhang et al.，2016a）。體外細(xì)胞實驗也發(fā)現(xiàn)，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以胞吞hiPS-MSC-Exos，并促進(jìn)細(xì)胞的遷移、增殖分化和成骨潛能（Zhang et al.，2016a）。在股骨滑車軟骨損傷的小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注入人胚胎誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體，透明軟骨層和軟骨下骨的再生會在12 周后的關(guān)節(jié)表面明顯看出，而關(guān)節(jié)內(nèi)注射磷酸鹽緩沖鹽水的對照組只發(fā)現(xiàn)了纖維組織的修復(fù)（Raposo et al.，2004）。體外將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells，Ad-MSCs）與富含血小板的血漿結(jié)合，并植入骨礦物質(zhì)基質(zhì)載體共同培養(yǎng)，8 周后發(fā)現(xiàn)了骨鈣素陽性的愈傷組織樣組織和骨細(xì)胞的增加，印證了Ad-MSCs 具有同樣的成骨潛能（Vladimir et al.，2015）。另一組實驗中，BMSCs 在成骨表現(xiàn)上，從細(xì)胞分離速度、新骨成型速度以及成骨量上都明顯優(yōu)于Ad-MSCs（Zhang et al.，2013）。在ECM 擴(kuò)增的hBMSCs 具有良好的向成骨分化的潛能，較低的向成脂分化的能力，因此，可將ECM 擴(kuò)增的hBMSCs 用于軟骨內(nèi)骨的修復(fù)和治療（Ming et al.，2011）。

OA 的發(fā)病和惡化受多種因素影響，具體機(jī)理尚不清楚。外泌體通過自身攜帶的miRNA、細(xì)胞因子、信號因子參與OA 的進(jìn)展來修復(fù)和治療OA，逐漸成為揭示OA 發(fā)病機(jī)制和治療手段的新的研究熱點（Furuta et al.，2016；Qin et al.，2016）。骨折愈合的時間會在MSCs-Exo 注射入小鼠骨折處后明顯縮短，測序后發(fā)現(xiàn)此過程中有與成骨相關(guān)的miR-196a、miR-27a、miR-206 及細(xì)胞因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1（Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、MCP-3、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 在BMSC-exosomes 中顯著高表達(dá)，且這些細(xì)胞因子及miRNA 的高表達(dá)會促使骨愈合加速（Furuta et al.，2016；Qin et al.，2016）。體外實驗表明，外泌體可以從β-TCP 釋放并被hBMSCs 內(nèi)化，并激活hBMSCs 的PI3K/Akt 信號通路來增強(qiáng)β-TCP 的骨生成（Zhang et al.，2016a）。研究發(fā)現(xiàn)，SMSC-140-Exo 帶有的Wnt5a 和Wnt5b 通過替代Wnt 信號通路激活YAP，并增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移，同時不損害ECM 的分泌（Shi-Cong et al.，2017）。通過miR-140-5p 轉(zhuǎn)染SMSCs 后，高表達(dá)的miR-140-5p 通過RalA 阻斷了這種減少SOX9 和細(xì)胞外基質(zhì)分泌的副作用。在MSCs 的其他研究中，MSCs 會在IGF-1 或BMP-6 與TGF-β3 共同作用下促進(jìn)向軟骨的分化和生成，但單獨的BMP-6 不能誘導(dǎo)軟骨形成（Indrawattana et al.，2004；Shi-Cong et al.，2017）。此外，骨軟骨祖細(xì)胞置于成年兔內(nèi)側(cè)股骨髁全層軟骨缺損處24 周后，軟骨下骨完全修復(fù)，而不損害覆蓋的關(guān)節(jié)軟骨（Wakitani et al.，1994）。自體注射BMSCs 后觀察山羊膝關(guān)節(jié)OA 軟骨組織的修復(fù)及再生，發(fā)現(xiàn)BMSCs 會顯著延緩軟骨下骨進(jìn)一步的硬化、骨贅生長的速度，促進(jìn)半月板組織的再生修復(fù)（Murphy et al.，2003）。此外，將透明質(zhì)酸中培養(yǎng)的MSCs 注射入豬股骨內(nèi)側(cè)髁的軟骨缺損處，發(fā)現(xiàn)軟骨注射后第6 周和第12周，組織學(xué)和形態(tài)學(xué)上的修復(fù)得到明顯改善（Lee et al.，2007）。通過綠色熒光蛋白標(biāo)記MSCs 并注射入動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，MSCs 在臨床和放射學(xué)上均具有顯著軟骨修復(fù)作用（Mokbel et al.，2011）。隨著研究的深入，從人體髂嵴的骨髓抽吸并分離出MSCs 進(jìn)行體外離體培養(yǎng)，注射到OA 患者的膝蓋中24 周后，退行性O(shè)A 受試者的軟骨和半月板生長明顯，疼痛減輕，關(guān)節(jié)活動度增加（Centeno et al.，2008）。 Emadedin 等（2012）在膝關(guān)節(jié)OA 患者關(guān)節(jié)內(nèi)注射BMSCs 后6 個月，患者在疼痛，膝關(guān)節(jié)功能狀態(tài)和行走能力方面均有改善，并可以在磁共振圖像（MRI）中明顯看出軟骨厚度的增加（Emadedin et al.，2012）。

5 運動對外泌體、骨性關(guān)節(jié)炎的影響

關(guān)節(jié)軟骨退行性變化是由多因素造成的，其中就包括營養(yǎng)缺乏（Zhuo et al.，2012）。軟骨細(xì)胞的營養(yǎng)有賴于關(guān)節(jié)的粘彈性和關(guān)節(jié)的運動，通過承重壓縮和釋放期間的滑膜液擴(kuò)散來滋養(yǎng)軟骨（Vanwanseele et al.，2002）。研究發(fā)現(xiàn)，兔髕骨關(guān)節(jié)面骨膜移植術(shù)重建后，進(jìn)行持續(xù)被動活動的治療效果優(yōu)于間歇性活動運動治療，證明持續(xù)被動活動由于連續(xù)的關(guān)節(jié)運動更具有益處（Moran et al.，1992）。關(guān)節(jié)負(fù)荷對于維持正常關(guān)節(jié)軟骨的生物學(xué)和功能特性具有重要的作用，在非正常負(fù)荷情況下，關(guān)節(jié)運動不能保持正常的關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)（Palmoski et al.，1980）。由此，運動強(qiáng)度可能是軟骨修復(fù)的重要影響因素（Galois et al.，2004）。有研究表明，對Wistar 大鼠進(jìn)行為期6 周的高強(qiáng)度運動訓(xùn)練之后，糖胺聚糖（Glycosaminoglycan，GAG）和膠原蛋白含量顯著降低，增加了軟骨退變的速度，而低或中等強(qiáng)度運動則對關(guān)節(jié)軟骨的病變產(chǎn)生有益影響（Kiviranta et al.，1988；Ni et al.，2011）。適度的跑步運動可改善關(guān)節(jié)軟骨的周圍環(huán)境、生理結(jié)構(gòu)和關(guān)節(jié)力學(xué)特性（Ni et al.，2011），防止關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)一步的退變（Carver et al.，1999）。體外實驗發(fā)現(xiàn)，兩種間歇壓力水平下，來自幼年細(xì)胞實驗組中的GAG 濃度比對非加壓幼年細(xì)胞和成體細(xì)胞中的濃度高10 倍，并且在1 000 psi 下的間歇性加壓中促進(jìn)了膠原蛋白的產(chǎn)生。上述結(jié)果表明，較高水平的間歇性壓力可能會對膠原蛋白產(chǎn)生更大的刺激，促進(jìn)其生成（Carver et al.，1999），且軟骨細(xì)胞可以在發(fā)育期間及整個成年期內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)和響應(yīng)各種機(jī)械刺激（Christopher et al.，2013）。

運動強(qiáng)度、運動類型及運動時間都會對關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨蛋白多糖（Proteoglycan，PG）或GAG 產(chǎn)生迥異的影響。大強(qiáng)度關(guān)節(jié)活動后，關(guān)節(jié)軟骨所含的PG 含量會降低（Arokoski et al.，2000）。研究表明，犬股骨髁上端的骨內(nèi)GAG 會在高負(fù)荷跑步后下降多達(dá)11%（Kiviranta et al.，1992）。其他動物實驗表明，軟骨組織中PG 的合成數(shù)量會在中等強(qiáng)度運動后增長（Murray et al.，1999）。5 個月大的馬駒膝軟骨的GAG 數(shù)量會在適量的鍛煉后增加，但當(dāng)鍛煉中止6 個月后，GAG 的數(shù)量逐漸穩(wěn)定（Firth et al.，2006），說明軟骨內(nèi)的GAG 受運動影響的這一現(xiàn)象是可逆轉(zhuǎn)的。在研究運動對軟骨關(guān)節(jié)組成的影響后發(fā)現(xiàn)，GAG 的數(shù)量會在適度的關(guān)節(jié)活動后得到增長（Eckstein et al.，2006；Jones et al.，2003）。中等強(qiáng)度的運動會改善半月板摘除后病人的關(guān)節(jié)癥狀及功能，使之適應(yīng)關(guān)節(jié)負(fù)荷的改變，增加軟骨中GAG的量，降低患OA的風(fēng)險（Andersson et al.，2006；Roos et al.，2005）。

外泌體廣泛存在于包括外周血在內(nèi)的所有體液中，但目前有關(guān)運動和外泌體的研究較少。在單次運動研究中，對個體進(jìn)行單車和跑臺兩種運動模式，分別采集運動前、運動后和運動后第90 min 的血漿樣品，從中分離外泌體，發(fā)現(xiàn)運動后血液所含外泌體的數(shù)量顯著增加；且相較于跑臺運動，單車運動后外泌體的數(shù)量在休息90 min 后會再次下降，證明外泌體的分泌會受運動方式的影響，這可能與跑臺運動需要調(diào)動更多的肌肉有關(guān)（Frühbeis et al.，2015）。為了更好揭示外泌體釋放動力學(xué)，在單車運動方案的每個階段另外采集血漿樣品，發(fā)現(xiàn)運動的早期階段，在個體達(dá)到無氧閾值（以乳酸的增加為特征）之前，已經(jīng)開始釋放外泌體，說明在運動的有氧階段，外泌體已經(jīng)發(fā)揮作用，并且在運動參與的適應(yīng)過程中參與細(xì)胞通信（Frühbeis et al.，2015）。對小鼠進(jìn)行單一運動訓(xùn)練后，對其血液進(jìn)行測試發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)ALIX 和Hsp70，它們是典型的外泌體標(biāo)記物，說明運動會誘導(dǎo)血液中攜帶Hsp60的外泌體釋放，從而促進(jìn)能量代謝（Barone et al.，2016）。運動中的壓力會使體內(nèi)血液中的外泌體快速增加。Bei等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在游泳3 周后，血液中外泌體增加了1.85 倍，隨后用IGF-1 處理H9C2 細(xì)胞以模擬體外運動刺激，發(fā)現(xiàn)與ALIX 和RAB35 活化相關(guān)的心肌細(xì)胞中外泌體的釋放增加，表明運動引起循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的外泌體增加，保護(hù)和避免了心肌I/R 損傷。Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子2（Kruppel-like factor 2，KLF2）是動脈粥樣硬化保護(hù)機(jī)制中血管內(nèi)皮生理表達(dá)的關(guān)鍵因子。在體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞（Smooth muscle cell，SMC）中用KLF2 轉(zhuǎn)導(dǎo)或剪切應(yīng)力刺激內(nèi)皮細(xì)胞，會增加富含miR-143/145 的外泌體分泌，并控制靶基因表達(dá)，減少小鼠主動脈中的動脈粥樣硬化病變的形成，表明miRNA 和外泌體的分泌可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和SMC 之間的通訊（Hergenreider et al.，2012）。與非運動組相比，運動可以增加外泌體的分泌量，降低2 型糖尿病患者的基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）活性，從而減輕糖尿病的癥狀（Chaturvedi et al.，2015）。綜上所述，運動通過促進(jìn)外泌體的分泌和流動速度來調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。體內(nèi)、外環(huán)境的改變會影響外泌體的分泌（Müller，2012），運動可能會對MSCs 的遷移和分化產(chǎn)生影響。體外實驗證明，細(xì)胞在受到缺氧刺激后會改變它分泌的外泌體成分，從而修復(fù)損傷組織（Tetta et al.，2011）。

圖2 運動影響OA發(fā)病的可能機(jī)制Figure 2.Possible Mechanisms of Exercise Affecting the OA Pathogenesis

運動可以發(fā)揮直接保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用，也可以間接激活MSCs 及MSCs-Exo 來保護(hù)和改善OA（圖2）。通過加載的同種異體的BMSCs 比無加載的同種異體移植和自體移植的BMSCs 產(chǎn)生更多的新骨（Hernigou et al.，2016）。加壓運動可加重骨髓的低氧代謝狀態(tài)，與非加壓運動條件下相比，長期處于加壓運動條件下的BMSCs 的形態(tài)更接近于形態(tài)上小而圓的原代細(xì)胞，更傾向于增殖，但分化能力受到抑制；在未加壓的常氧狀態(tài)下，BMSCs 多呈梭狀，會在誘導(dǎo)后分化為心肌樣細(xì)胞，表明常氧狀態(tài)下的BMSCs 比其在缺氧后更趨向于進(jìn)行分化（楊玉輝等，2016）。Zhang 等（2017）的實驗表明，中等水平的運動可能會增加成骨MSCs 的數(shù)量，而低或者高水平的對照組沒有顯著變化。運動可以促使參與骨形成的原代BMSCs 的增殖和分化，使之有助于骨形成。機(jī)械拉伸可以增強(qiáng)體外BMSCs 向成骨細(xì)胞的分化，減少向脂肪的轉(zhuǎn)化（Liu et al.，2017）。

6 小結(jié)與展望

MSCs-Exo 通過分泌作用、免疫調(diào)節(jié)、成骨能力等途徑在骨性關(guān)節(jié)炎的修復(fù)過程中起到重要作用，但MSCs-Exo對膝骨關(guān)節(jié)炎修復(fù)的作用機(jī)制還不明確，在臨床實驗領(lǐng)域應(yīng)用較少；在軟骨修復(fù)中，仍然存在關(guān)于治療功效、生物安全性、動力學(xué)和生物分布等重要問題，需要在大型動物研究中驗證。外泌體為臨床OA 治療提供了一種全新的思路，特別是MSCs-Exo 的體外注射，有可能成為OA 治療的一種新途徑。科學(xué)運動對于MSCs 的分泌及軟骨再生具有積極的促進(jìn)作用。如何通過科學(xué)運動促進(jìn)MSCs及MSCs-Exo 的分泌，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨機(jī)械力學(xué)變化，從而避免OA 發(fā)生或者緩解OA 病灶進(jìn)一步蔓延，成為運動干預(yù)OA 的一種潛在干預(yù)機(jī)制。下一步應(yīng)對運動改善外泌體的分泌和功效及臨床康復(fù)過程中通過運動與外泌體的結(jié)合治療骨關(guān)節(jié)炎等，在臨床實驗中進(jìn)行驗證，使之有可能成為臨床康復(fù)治療OA 的一種全新手段，也可為OA 和外泌體的干預(yù)途徑研究提供嶄新的視角。