周 洲，李世凱，趙 飛，陳飛雄，孔 杰

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025)

西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)屬鱘形目、鱘科、鱘屬，生長(zhǎng)速度快、魚(yú)籽醬品質(zhì)高，是目前我國(guó)鱘魚(yú)類(lèi)人工養(yǎng)殖的主要品種之一。貴州自2012年實(shí)現(xiàn)西伯利亞鱘全人工繁育以來(lái)，目前養(yǎng)殖面積已超過(guò)8萬(wàn)m2，優(yōu)質(zhì)苗種供應(yīng)不足已經(jīng)成為限制貴州鱘魚(yú)規(guī)?；B(yǎng)殖的瓶頸。精子超低溫冷凍保存技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)精子的長(zhǎng)期保存，對(duì)魚(yú)類(lèi)種質(zhì)資源保存和優(yōu)良品種的選育具有決定性的影響，目前已在日本鱘、中華鱘、西伯利亞鱘、史氏鱘和達(dá)氏鱘[1-5]等鱘魚(yú)類(lèi)中有較多報(bào)道，但凍存激活后精子的活力和受精率難達(dá)到鮮精的水平。酶活性檢測(cè)法是評(píng)價(jià)精子超低溫冷凍保存效果的一種常用檢測(cè)辦法，目前已應(yīng)用于大黃魚(yú)、花鱸、長(zhǎng)鰭籃子魚(yú)及俄羅斯鱘等魚(yú)類(lèi)精子超低溫冷凍保存研究中[6-9]。因此，試驗(yàn)通過(guò)分析超低溫冷凍前后西伯利亞鱘精子酶活性的變化，檢測(cè)鮮精和凍精質(zhì)量，探討超低溫冷凍保存對(duì)精子酶活性的影響，以期對(duì)西伯利亞鱘精子超低溫冷凍保存體系優(yōu)化及冷凍精子保存效果提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 西伯利亞鱘精液樣本的采集和制備

1.1.1 樣本采集 親本均來(lái)自貴州省水產(chǎn)研究所惠水養(yǎng)殖基地。于2019年4月在西伯利亞鱘繁殖期間，選體長(zhǎng)(1.42±0.25)m、體重(18.6±3.5)kg的性腺發(fā)育成熟的雄魚(yú)5尾，進(jìn)行人工催產(chǎn)取精。取精時(shí)，用干凈的干毛巾擦去鱘魚(yú)體表和生殖孔周?chē)乃旨拔畚?，將生理鹽水洗凈的塑料軟管輕輕插入生殖孔，用手輕輕擠壓其腹部使精液自然經(jīng)導(dǎo)管流入干凈干燥的50 mL離心管中，并通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)快速檢測(cè)精子活力情況，選取精子活力大于90%的精子樣本用于試驗(yàn)。

1.1.2 樣本制備 將采集的精液分為2組，即鮮精組(對(duì)照)和凍精組。選取體積分?jǐn)?shù)15%的二甲基亞砜(DMSO)作為抗凍劑，以KCl 0.25 mmol/L、蔗糖23.4 mmol/L、Tris-HCL 10 mmol/L(pH 8.5)作為稀釋液[10]，將精液以1∶1的體積比加入配制好的抗凍保護(hù)液，混勻平衡后，將裝有精液的冷凍管置于液面以上6 cm處平衡2 min，之后在液面以上2 cm處平衡2 min，最后在平行于液氮面平衡2 min后投入液氮中。精子解凍時(shí)將凍存管從液氮中取出，立即放入備好的恒溫為37℃的水浴鍋中，輕輕搖晃至凍存管中沒(méi)有小絮狀冰塊為止。解凍后的精子經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)分析精子活力在30%左右，將2個(gè)處理組的樣本在3 000 r/min、4℃條件下離心15 min，去除精漿后，向白色精子沉淀中加入0.9%生理鹽水洗滌，同樣條件下離心、洗滌2次，最后將精子置于-20℃冷凍保存。待需要檢測(cè)時(shí)，將樣本放置于4℃條件下緩慢融化，繼續(xù)在3 000 r/min、4℃條件下離心 15 min，取上清液中間位置用于西伯利亞鱘精子內(nèi)相關(guān)酶活性的檢測(cè)。

1.2 酶活性的檢測(cè)

采用南京建成生物工程研究所的酶活檢測(cè)試劑盒測(cè)定西伯利亞鱘精子內(nèi)總ATP酶(Totoal ATPase)、谷胱甘肽還原酶(GR)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、過(guò)氧化氫酶(CAT)及超氧化物歧化酶(SOD)的酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)設(shè)5個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 19.0對(duì)西伯利亞鱘精子冷凍前后各種酶活性的差異顯著性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超低溫冷凍前后西伯利亞鱘精子能量代謝的酶活性

從圖 1可知，西伯利亞鱘新鮮精子中總ATP酶、CK酶、LDH酶和SDH酶的活性均是新鮮精子高于超低溫冷凍保存的精子，其中，超低溫冷凍前后西伯利亞鱘精子總ATP酶的平均活力由(18.77±1.23)U/mL降至(16.32±0.87)U/mL，CK酶由(6.64±0.58)U/mL降至(5.27±0.23)U/mL，LDH酶由(6 695.78±123.47)U/L降至(4 388.32±93.28)U/L，SDH酶由(24.91±1.63)U/mL降至(17.45±0.94)U/L。超低溫冷凍前后總ATP酶活性差異不顯著性(P>0.05)，CK酶、LDH酶和SDH酶的活性差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

2.2 超低溫冷凍前后西伯利亞鱘精子的抗氧化酶活性

從圖2可知，超低溫冷凍后西伯利亞鱘精子中SOD酶和CAT酶活性均低于新鮮精子，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)；GR酶活性則高于新鮮精子，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。其中，超低溫冷凍前后SOD酶平均活力由(61.99±4.15)U/mL降至(46.38±2.54)U/mL，CAT酶由(112.33±6.38)U/mL降至(67.58±3.87)U/mL，GR酶由(23.36±1.69)U/mL增至(94.61±4.13)U/mL。

注：同一圖中不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)5%顯著水平。
Note:Different lowercase lellers in the same graph indicate significance of difference atP<0.05 level.
圖1西伯利亞鱘精子超低溫冷凍保存和新鮮精子中能量代謝的酶活性
Fig.1 Total enzyme activity of energy metabolism of cryopreservation and fresh spermatozoa inA.baerii

3 結(jié)論與討論

魚(yú)類(lèi)精子內(nèi)的能量代謝酶與精子的活力有密切的關(guān)系，目前精子內(nèi)常見(jiàn)的能量代謝酶有總ATP酶、SDH酶、CK酶及 LDH酶等，其酶活性可以用來(lái)分析精子質(zhì)量[11-13]。ATP酶可將其酶解釋放的能量用于生命體各項(xiàng)生命活動(dòng)，精子開(kāi)展各種需能活動(dòng)都需要ATP酶以獲得能量，因此可用ATP酶活性判斷精子是否受到損傷[14]。研究發(fā)現(xiàn)，線(xiàn)粒體特征酶SOD活性可判斷超低溫冷凍前后精子內(nèi)線(xiàn)粒體功能是否受損[12,15]。LDH酶是精子能量代謝過(guò)程中的一種糖酵解酶，可通過(guò)呼吸作用給精子提供能量，因此該酶的活性可以作為衡量精子質(zhì)量的一個(gè)生化指標(biāo)[16]。CK酶通常存在于各類(lèi)細(xì)胞漿和線(xiàn)粒體中，是與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)和 ATP酶再生有直接關(guān)系的重要激酶[17]。黃曉榮等對(duì)大黃魚(yú)精子的研究表明，經(jīng)過(guò)超低溫冷凍保存后，大黃魚(yú)精子中總 ATP酶、CK酶、SDH酶和 LDH酶的活性均顯著低于鮮精。徐濱等[18]研究表明，超低溫冷凍后俄羅斯鱘精子的總 ATP酶、SDH酶、LDH酶和CK酶的平均活性均下降。國(guó)外學(xué)者研究超低溫冷凍保存對(duì)虹鱒 (Oncorhynchusmykiss)精子中能量代謝酶酶活性的影響發(fā)現(xiàn)，超低溫冷凍后精子中LDH酶、CK酶及總ATP酶的活性均呈顯著降低趨勢(shì)[19]。筆者等研究也發(fā)現(xiàn)，超低溫冷凍保存后，凍精中的總ATP酶、SDH酶、CK酶及 LDH酶等能量代謝相關(guān)酶活性均降低，其中SDH酶、CK酶及 LDH酶活性顯著降低，表明超低溫冷凍保存對(duì)鱘魚(yú)精子相關(guān)生命活動(dòng)產(chǎn)生了影響，從而降低了鱘魚(yú)精子的受精能力。一方面可能是由于超低溫冷凍對(duì)精子能量代謝相關(guān)酶的結(jié)構(gòu)造成一定的傷害，另一方面也可能是超低溫冷凍保存及解凍使精子受到機(jī)械損傷，從而導(dǎo)致精子內(nèi)的相關(guān)酶從細(xì)胞膜中溢出。在長(zhǎng)鰭籃子魚(yú)精子、日本鰻鱺[20]等魚(yú)類(lèi)超低溫冷凍保存研究報(bào)道都得出一致的結(jié)論。同時(shí)，西伯利亞鱘凍精中總ATP酶未出現(xiàn)顯著降低，也反映了試驗(yàn)采用的西伯利亞鱘精子冷凍保存劑具有較好的保護(hù)作用，可以用于長(zhǎng)期超低溫冷凍保存西伯利亞鱘精子。

氧化酶活性的變化可以反映細(xì)胞在不同外界環(huán)境下的生理狀態(tài)，是用來(lái)判斷其是否受到損傷的重要生理指標(biāo)[8,21]。相關(guān)研究報(bào)道[9,22]均表明，魚(yú)類(lèi)精子抗氧化酶SOD及CAT都與精子的活力具有密切的關(guān)系。GR酶是一種黃素酶，其在緩解因冷脅迫所產(chǎn)生的活性氧危害也具有重要的作用[23]。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究超低溫冷凍保存對(duì)中國(guó)花鱸、長(zhǎng)鰭籃子魚(yú)、俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedti)以及日本鰻鱺[20]等魚(yú)類(lèi)精子酶活性的影響發(fā)現(xiàn)，凍存后精子內(nèi)的抗氧化酶呈現(xiàn)不同的變化，其中精子內(nèi)SOD及CAT酶活性顯著下降，而精子內(nèi)GR酶活性則顯著上升。筆者等的研究結(jié)果表明，經(jīng)超低溫冷凍保存后，西伯利亞鱘精子的GR酶活性顯著高于鮮精，SOD酶、CAT酶活性均顯著低于鮮精，與上述研究報(bào)道相一致。SOD酶和CAT酶活性顯著降低，表明超低溫冷凍對(duì)西伯利亞鱘精子細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)造成損傷，從而不能及時(shí)清除氧化還原循環(huán)產(chǎn)生的大量活性氧，進(jìn)而造成對(duì)精子的一系列氧化損傷，從而導(dǎo)致精子受精能力降低。同時(shí)，GR酶的升高又驗(yàn)證了其活性可以保護(hù)精子免受外界冷凍脅迫中發(fā)揮重要作用。但目前有關(guān)GR酶在魚(yú)類(lèi)精子超低溫冷凍保存中如何發(fā)揮作用的機(jī)制原理尚未見(jiàn)研究報(bào)道。

魚(yú)類(lèi)精子超低溫冷凍保存技術(shù)對(duì)物種遺傳種質(zhì)資源保護(hù)及苗種生產(chǎn)都具有重要價(jià)值，貴州省水產(chǎn)研究所實(shí)現(xiàn)了對(duì)西伯利亞鱘精子超低溫冷凍保存技術(shù)的突破，但凍存激活后精子的活力和受精率總難達(dá)到鮮精的水平。筆者等研究對(duì)超低溫冷凍前后西伯利亞鱘精子總ATP酶、GR酶、CK酶、LDH酶、SDH酶、CAT酶及SOD酶等7種酶活性進(jìn)行研究，其中凍精中總ATP酶、SDH酶、CK酶和 LDH酶等4種能量代謝相關(guān)酶，SOD酶和CAT酶等2種抗氧化酶活性均有所降低，這在一定程度上解釋了凍精的受精能力顯著低于鮮精。因此，在開(kāi)展魚(yú)類(lèi)精子超低溫冷凍保存條件摸索過(guò)程中，可以通過(guò)比較凍精中相關(guān)酶活性的高低判斷凍精受精能力的大小，從而指導(dǎo)尋找魚(yú)類(lèi)精子超低溫冷凍保存最優(yōu)的稀釋液和抗凍劑。