半滑舌鰨蛋白激酶C-alpha(PKCα)的基因克隆和免疫應答分析*

李坤明 徐文騰 扶曉琴 陳松林

半滑舌鰨蛋白激酶C-alpha(PKCα)的基因克隆和免疫應答分析*

李坤明1,2徐文騰1,3扶曉琴1,4陳松林1,3①

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071；2. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306；3. 農業(yè)農村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 青島 266071；4. 南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院 無錫 214081)

蛋白激酶C(PKC)廣泛參與哺乳動物T、B淋巴細胞涉及的免疫反應并發(fā)揮重要作用，然而PKC在魚類免疫過程中的作用卻少有報道。本研究在半滑舌鰨()中克隆了PKC家族的典型成員(命名為)，并進行了分子特征和表達模式分析。的cDNA全長為2315 bp，其中，開放閱讀框(ORF)為2013 bp。qRT-PCR分析顯示，在各個組織中廣泛表達，其中，在鰓、肝臟、皮膚和腸中具有較高的轉錄水平，表明可能在免疫過程中發(fā)揮作用。隨后檢測了在哈維氏弧菌()感染后6種免疫相關組織(鰓、肝臟、皮膚、腸、脾臟和腎)中不同時間點的表達水平，發(fā)現(xiàn)細菌侵染后24 h或48 h，在鰓、腎臟、皮膚和脾臟中顯著上調，侵染后12 h在肝中有顯著性下調。研究表明，可能在應對哈維氏弧菌的免疫應答中發(fā)揮作用，但是否參與病原菌侵染的巨噬細胞激活以及與T、B細胞相關的信號通路還需要進一步研究。這是關于參與魚類細菌性免疫反應的首次報道。

半滑舌鰨；蛋白激酶C-alpha；哈維氏弧菌；免疫應答

蛋白激酶C(PKC)是一類與絲氨酸/蘇氨酸磷酸化密切相關的蛋白家族，可以介導多種細胞功能，例如細胞的存活、增殖和分化等(Moscat, 2003)。目前，至少有11個PKC家族成員被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)結構和激活方式分為3類：PKC(α、bⅠ、bⅡ和γ)、PKC(δ、ε、θ、μ和η)和PKC(ζ、τ和λ) (Newton, 2001; Guo, 2004)。

PKCα是PKC家族成員中一種典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶(Nakashima, 2002)。PKCα在機體中普遍存在，可以通過多種方式被激活，并參與多種細胞功能，包括細胞增殖、分化、能動性、凋亡和炎癥(Nakashima, 2002; Singh, 2017)。至今，已有大量關于PKCα參與免疫與炎癥反應的研究報道，與免疫應答密切相關。如Alvaro等(1997)指出，抑制PKCα可以顯著抑制細菌性脂多糖(LPS)誘導巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子；Volkov等(2001)研究發(fā)現(xiàn)，PKCα參與PI3K/Akt信號通路的激活，進而調控T細胞的多種生理功能，參與產(chǎn)生特異性淋巴細胞效應因子(Baier, 2009)；在轉基因小鼠()的表皮中過表達PKCα的研究表明，其可以顯著改變12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(TPA)誘導的炎癥反應，水腫和中性粒細胞浸潤，以及與炎癥相關基因的表達，如環(huán)氧酶-2和腫瘤壞死因子-α (TNF-α) (Wang, 1999)；研究指出，PKCα參與干擾素調節(jié)因子3的激活和I型干擾素β的合成(Johnson, 2007)，還可以通過核因子kappa-B (NF-κB)抑制蛋白(IKB)負調節(jié)NF-κB誘導的參與各種炎癥反應的基因的表達(Han, 1999)。

另外，Christina等(2013)研究指出，PKCα與PKCβ在多數(shù)情況下協(xié)同行使功能，如調節(jié)T細胞中的白介素-2的表達；使用PKCα/β抑制劑預處理嗜中性粒細胞可以減少NF-κB的核轉位和促炎細胞因子TNF-α的產(chǎn)生，抑制PKCα/β可以阻止LPS或肽聚糖(PGN)誘導的NF-kB激酶抑制劑alpha/beta(IKKα/β)磷酸化被激活，IKB alpha的磷酸化和降解，以及NF-κB的p65亞基的磷酸化(Asehnoune, 2005)。

半滑舌鰨()屬鰈形目，俗稱“龍脷”，是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類。近年來，半滑舌鰨養(yǎng)殖過程中細菌性疾病日益嚴重，其導致的魚苗死亡造成了較高的經(jīng)濟損失，而哈維氏弧菌()是其病害發(fā)生的主要病原體之一。對于半滑舌鰨免疫相關功能研究和細菌防控手段展開深入研究將有助于半滑舌鰨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，免疫相關的研究主要集中在哺乳動物(Wang, 1999)，而在魚類中鮮有報道。為了研究在免疫過程中的功能，本研究對進行了克隆，并對基因結構、組織分布以及響應哈維氏弧菌刺激后的基因表達變化進行了研究，發(fā)現(xiàn)基因參與免疫反應，為其后續(xù)相關功能的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

本實驗所用的半滑舌鰨均來源于山東省黃海水產(chǎn)有限公司。

1.2 樣品采集

3條15月齡健康半滑舌鰨成魚，體長為(22.8± 1.8) cm，體重為(85.6±6.5) g，麻醉后分別取肝臟、脾臟、腎臟、鰓、腸、肌肉、心臟、腦、性腺、皮膚等組織，迅速放入RNA保存液中，置于-20℃冰箱中保存。

使用10月齡的60條健康半滑舌鰨進行哈維氏弧菌感染實驗，具體實施方案參照先前的操作步驟(Wei, 2017; 王雙艷等, 2019)，腹腔注射的細菌濃度為1.0×104CFU/ml。將魚麻醉后采集肝臟、脾臟、腎臟、腸、鰓和皮膚6個免疫相關組織，分別在感染前0 h和注射后12、24、48和72 h進行樣品采集并以感染前0 h作為對照，每個時間點分別隨機采集3條魚，采集的樣品迅速放入RNA保存液中，置于-20℃冰箱中保存。

1.3 RNA提取及cDNA合成

采用Trizol法(Invitrogen)提取半滑舌鰨各組織中的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，Gene Quant Pro RNA/DNA分光光度計檢測其純度與濃度。RNA鑒定合格后，使用cDNA反轉試劑盒(TaKaRa)合成cDNA，RACE(TaKaRa)試劑盒合成RACE- Ready-cDNA。

1.4 PKCα基因全長cDNA的克隆

根據(jù)已發(fā)表的半滑舌鰨全基因組序列(Chen, 2014)，獲得基因部分cDNA序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)，以肝、脾、腎、腸和鰓的混合cDNA為模板進行普通PCR擴增驗證，PCR反應體系：Ex(TaKaRa) Mix 25 μl，上下游引物各2 μl，ddH2O 19 μl，模板cDNA 2 μl；程序為：95℃預變性2 min，35個循環(huán)(95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸時間90 s)，72℃延伸10 min，4℃保存。利用膠回收試劑盒(OMEGA)對PCR產(chǎn)物進行回收純化，連接到pEASY-T1載體后，按照該載體說明書進行后續(xù)基因克隆實驗，最終挑取陽性克隆送華大基因有限公司測序。

根據(jù)Smart RACE cDNA擴增試劑盒(TaKaRa)說明書進行5￠-RACE和3￠-RACE，通過巢式PCR進行擴增。以上述驗證得到的cDNA序列為基礎設計5￠-RACE和3￠-RACE的引物。用通用引物UPM和通用引物NUP進行巢式PCR。本研究中使用的所有引物信息見表1。為了確保擴增的特異性，進行Touchdown PCR反應，所用程序參照之前的方法(Guo, 2017)。

1.5 生物學分析及進化樹構建

使用DNAstar軟件對克隆得到的序列進行拼接分析，得到s全長cDNA序列，并查找ORF以及氨基酸序列，預測蛋白分子量及等電點；PKCα同源性分析使用BioEdit軟件和NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast程序進行物種間的氨基酸序列比對；利用SMART在線軟件分析其蛋白結構域；通過MEGA 7.0軟件鄰接法(NJ)完成生物系統(tǒng)進化樹構建(Kumar, 2016)。

表1 本研究所用的引物

1.6 PKCα基因表達模式檢測

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測基因在正常生理條件下，半滑舌鰨不同組織中的表達水平和哈維氏弧菌感染后不同時間點免疫相關組織中的表達模式。每個樣品設置3個重復。根據(jù)得到的ORF區(qū)序列設計實時熒光定量引物(表1)，以基因為內參。qRT-PCR的反應體系參照SYBR?Premix ExTMⅡ(TaKaRa)試劑盒說明書，使用ABI 7500 Fast Real-time (Applied Biosystems, 美國)程序下進行基因的定量分析。本實驗釆取2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量，采用SPSS 16.0軟件對基因的表達量進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。設定0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 cDNA序列分析

scDNA全長為2315 bp，其中，ORF為2013 bp，編碼670個氨基酸，5￠UTR為218 bp，3￠UTR為84 bp，預測蛋白相對分子質量為76.37 kDa，理論等電點為6.44。該基因的氨基酸序列337~595aa區(qū)段為典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域(圖1)。

圖1 CsPKCα cDNA 全長和推導的氨基酸序列

如圖2所示，在CsPKCα中鑒定了保守結構域。N末端含有2個蛋白激酶C保守區(qū)1(C1)結構域和1個蛋白激酶C保守區(qū)2(C2)結構域。C1結構域具有以磷脂和鋅依賴的方式結合二?；视秃头鸩ù减サ墓δ?，而C2結構域則負責Ca2+依賴性膜蛋白質的結合，從而進行細胞信號轉導(Davletov, 1993; Medkova, 1999)。C末端具有1個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域(S_TKc)和1個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶延伸結構域(S_TK_X)，兩者均可以與ATP結合，行使蛋白激酶活性(Knighton, 1991)。

圖2 CsPKCα保守結構域

水平灰條表示預測沒有功能域的氨基酸序列，而彩色框則表示預測有功能域的區(qū)域。注釋結構域：C1，蛋白激酶C保守區(qū)1(C1)結構域；C2，蛋白激酶C保守區(qū)2(C2)結構域；S_TKc，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域；S_TK_X，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶延伸結構域。相對于氨基酸序列的長度和位置顯示蛋白質結構域

The horizontal gray bars represent amino acid sequences without predicted functional domains, whereas the colored boxes represent the regions with confidently predicted domains. Annotated domains: C1, Protein kinase C conserved region 1 (C1) domain; C2, Protein kinase C conserved region 2 (C2) domain; S_TKc, Serine/Threonine protein kinases, catalytic domain; S_TK_X, Extension to Ser/Thr-type protein kinases domain. Protein domains are shown relative to the length of and the position in the amino acid sequences

2.2 同源性分析

為了評估脊椎動物PKCα氨基酸的相似性/差異，對半滑舌鰨和其他脊椎動物的PKCα進行了多序列比對。結果顯示，CsPKCα編碼的氨基酸序列與其他物種PKCα編碼氨基酸序列具有不同程度的相似度(81%~92%)，其中，與尖吻鱸()的相似度為92%，與牙鲆()相似度為88%，與人()相似度為81%，氨基酸序列比對信息見圖3。

2.3 系統(tǒng)進化分析

為了解PKCα在不同物種中的進化關系，使用Mega 7.0的NJ程序對來自18個物種的PKCα的氨基酸序列進行了系統(tǒng)發(fā)育分析(10種硬骨魚，8種其他脊椎動物)。系統(tǒng)進化樹顯示，硬骨魚聚為一支，其中，半滑舌鰨與牙鲆、亞馬遜花鳉()、劍尾魚()等進化地位較為接近，其他脊椎動物(鳥類、爬行類、兩棲類和哺乳類)聚為一支，其中，屬于兩棲類的熱帶爪蟾()、鳥類中的原雞()和爬行類的揚子鱷()產(chǎn)生分支，與哺乳動物進化地位較遠(圖4)。

2.4 組織表達分析

為了評估在半滑舌鰨不同組織中的表達模式，通過qRT-PCR檢測了其在肝臟、脾臟、腎臟、鰓、腸、肌肉、心臟、腦、性腺、皮膚等組織等10種組織中的mRNA表達水平。結果顯示，基因在半滑舌鰨各個組織中均有表達，其中，在免疫相關組織鰓、腸、皮膚和肝臟中表達量相對較高(圖5)。

2.5 哈維氏弧菌感染后的應答模式分析

為了初步探究在半滑舌鰨免疫反應中的作用，結合上述組織表達結果，使用qRT-PCR測定哈維氏弧菌感染后6種免疫相關組織(鰓、腸、皮膚、脾、肝和腎)中基因的表達水平。將不同采樣時間點的表達水平與0 h時的表達水平進行比較。檢測結果顯示，哈維氏弧菌感染后，基因在鰓、腎臟、肝臟、脾臟、皮膚中均有顯著性差異表達，分別在鰓48 h、腎臟24 h、脾臟48 h和皮膚48 h時出現(xiàn)顯著性上調，在肝臟12 h時檢測到顯著性下調。然而，腸中感染后未出現(xiàn)顯著性變化(圖6)。

3 討論

本研究通過RACE方法獲得了半滑舌鰨基因cDNA全長，并進行了基因的序列鑒定，預測出其具有典型的蛋白激酶C保守區(qū)1和保守區(qū)2，以及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結構域是蛋白激酶最為關鍵的結構域，蛋白激酶C對蛋白底物的絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化即通過該結構域來完成，進而調節(jié)蛋白質的生物活性狀態(tài)，影響細胞活動如細胞內外信號傳導，細胞周期進程，細胞內運輸?shù)?Haas, 1992; 康涵等, 2012)。

圖3 不同物種PKCα氨基酸序列比對

氨基酸序列GenBank號：人(XP_016880325.1)；小家鼠(NP_035231.2)；斑馬魚(NP_001243170.1)；牙鲆(XP_019939809.1)；劍尾魚(XP_023190086.1)；羅非魚(XP_019215250.1)；亞馬遜花鳉(XP_016534709.1)；尖吻鱸(XP_018520387.1)；半滑舌鰨(XP_008315545.1)

The GenBank accession numbers of amino acid sequences used for multiple sequence alignment are as follows:(XP_016880325.1);(NP_035231.2);(NP_001243170.1);(XP_019939809.1);(XP_023190086.1);(XP_019215250.1);(XP_016534709.1);(XP_018520387.1);(XP_008315545.1)

圖4 基于半滑舌鰨等硬骨魚和其他脊椎動物PKCα的系統(tǒng)進化樹

氨基酸序列GenBank號：人(XP_016880325.1)；小家鼠(NP_035231.2)；原牛(NP_776860.1)；原雞(NP_001012822.1)；家犬(XP_022278565.1)；野豬(XP_020922399.1)；揚子鱷(XP_025052051.1)；綿羊(XP_014954487.1)；熱帶爪蟾(NP_001072752.1)；斑馬魚(NP_001243170.1)；牙鲆(XP_019939809.1)；劍尾魚(XP_023190086.1)；雀鱔(XP_015211748.1)；羅非魚(XP_019215250.1)；低眼無齒鷶(XP_026789328.1)；亞馬遜花鳉(XP_016534709.1)；尖吻鱸(XP_018520387.1)；半滑舌鰨(XP_008315545.1)

The GenBank accession numbers of the amino acid sequences used for phylogenetic analysis are as follows:(XP_016880325.1);(NP_035231.2);(NP_776860.1);(NP_001012822.1);(XP_022278565.1);(XP_020922399.1);(XP_025052051.1);(XP_014954487.1);(NP_001072752.1);(NP_001243170.1);(XP_019939809.1);(XP_023190086.1);(XP_015211748.1);(XP_019215250.1);(XP_026789328.1);(XP_016534709.1);(XP_018520387.1);(XP_008315545.1)

圖5 CsPKCα mRNA 在不同組織中的表達水平

SK：皮膚；M：肌肉；B：腦；H：心臟；K：腎臟；SP：脾臟；L：肝臟；I：腸；G：性腺；GI：鰓。顯示數(shù)值為平均值±標準差(=3)，不同字母間表示差異顯著(<0.05)，下同

SK: Skin; M: Muscle; B: Brain; H: Heart; K: Kidney; SP: Spleen; L: Liver; I: Intestine; G: Gonad; GI: Gill. Values are indicated as Mean±SE (=3). The expression levels with the same letter are not significantly different (<0.05). The same as below

氨基酸序列比對顯示，PKCα在硬骨魚和哺乳動物中高度保守，相似度高達81%以上(圖3)，這表明PKCα可能在硬骨魚和哺乳動物之間具有相似的功能。至今，PKCα的研究主要集中于哺乳動物，其參與T、B細胞的多種免疫反應(Volkov, 2001; Guo, 2004)，并可以顯著改變炎癥誘導的反應以及炎癥相關基因的表達(Wang, 1999)等，但相關免疫反應機制還需進一步闡明，在半滑舌鰨中的研究有待繼續(xù)開展。

qRT-PCR檢測的組織表達模式結果顯示，在半滑舌鰨各個組織廣泛表達，其中，在免疫相關組織鰓中表達最高，鰓是水生生物與外部水環(huán)境接觸的主要組織，是防御病原體入侵的第一道防線(Li, 2015; 王貞杰等, 2017)，另外，在免疫相關組織肝臟、皮膚和腸中也有較高的表達。為了進一步研究基因對哈維氏弧菌的響應模式，檢測了基因在哈維氏弧菌感染后鰓，腎臟、脾臟、肝臟、皮膚和腸等6個組織的表達情況。結果顯示，mRNA在鰓、腎臟、脾臟、皮膚中均出現(xiàn)顯著性上升，其中，鰓和脾臟的表達量在48 h出現(xiàn)峰值，腎臟的表達量在24、48和72 h一直維持高表達，皮膚的表達量在24~72 h持續(xù)上升，顯示后期在皮膚中一直處于應答狀態(tài)。這與PKCα高表達于哺乳動物的肝臟、脾臟、腎臟和皮膚并行使免疫相關功能極為類似(Dean, 1994; Dorr, 1998)。魚類特有的鰓，作為硬骨魚的呼吸器官，也是其防止病原菌侵染的首要防線，哈維氏弧菌感染后在鰓中的表達量顯著上調，顯示出免疫應答反應，值得注意的是，在哺乳動物中同為呼吸器官的肺也是PKCα高表達并發(fā)揮免疫反應的重要場所(Dean, 1994; Lahn, 2004)。然而，的表達量在腸中一直無顯著變化，表明可能不參與哈維氏弧菌感染后腸中的免疫相關反應，而組織分布檢測到在腸中具有較高的表達，這可能與PKCα參與營養(yǎng)調節(jié)有關(Bergan, 2012)。另外，通過小鼠巨噬細胞的細菌響應研究發(fā)現(xiàn)，細菌DNA可通過活化PKCα、PKCβII和NF-κB來激活巨噬細胞(王立生等, 2007)。巨噬細胞已被廣泛認知具有重要的生物學功能，參與生物機體非特異性和特異性免疫反應，通過噬菌作用清除病原體(Gordon, 2010)。因此，有關魚類PKCα是否參與激活巨噬細胞來增強機體對病原菌的免疫耐受力將是未來需要解決的研究課題之一。

圖6 CsPKCα mRNA在哈維氏弧菌感染后鰓、腎臟、肝臟、脾臟、皮膚和腸中的表達水平

目前，魚類中基因的克隆及免疫相關功能的研究鮮有報道。本研究對半滑舌鰨基因進行了cDNA全長克隆、序列鑒定、進化分析以及表達模式的研究，進行了響應哈維氏弧菌的免疫應答分析，為魚類基因后續(xù)的功能研究提供了參考資料。

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Cloning and Immune Response Analysis of Protein Kinase C-alpha (PKCα) in Chinese Tongue Sole ()

LI Kunming1,2, XU Wenteng1,3, FU Xiaoqin1,4, CHEN Songlin1,3①

(1. Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao 266071;4. Wuxi Fisheries College, Nanjing Agricultural University, Wuxi 214081)

Protein kinase C (PKC) plays an important role in T and B lymphocyte-mediated immune response. However, the function of PKC is rarely reported in teleost fish. In this study, we have cloned theα gene (namely), a typical member of the PKC family, and characterized its molecular features and expression pattern.cDNA is 2315 bp in length, with an open reading frame (ORF) of 2013 bp. qRT-PCR analysis showed thatwas expressed in various tissues, with a high transcription levels in the gill, liver, skin, and intestine, suggesting that it may play a role in immunity. Subsequently, we examined the expression ofat different time points in six immune-related tissues (the gill, liver, skin, intestine, spleen, and kidney) after infection with.was significantly upregulated in the gill, kidney, skin, and spleen at 24 h or 48 h post-infection (hpi) and downregulated in the liver at 12 hpi. The results suggested that PKCα might be involved in the immune response to; however, whether it is involved in macrophage activation during bacterial pathogen infection and the signaling pathways associated with T and B cells requires further investigation. This is the first report, to our knowledge, on the involvement of PKCα in the immune response to bacterial infection in fish.

Chinese tongue sole; Protein kinase C-alpha;; Immune response

Q522

A

2095-9869(2020)02-0069-09

陳松林，研究員，E-mail: chensl@ysfri.ac.cn

2019-02-19,

2019-03-08

* 國家自然科學基金項目(31530078)和山東省泰山學者攀登計劃項目共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31530078), and Taishan Scholar Climbing Program of Shandong Province]. 李坤明，E-mail: qqkmli@163.com

10.19663/j.issn2095-9869.20190219001

http://www.yykxjz.cn/

李坤明, 徐文騰, 扶曉琴, 陳松林. 半滑舌鰨蛋白激酶C-alpha(PKCa)的基因克隆和免疫應答分析. 漁業(yè)科學進展, 2020, 41(2): 69–77

Li KM, Xu WT, Fu XQ, Chen SL. Cloning and immune response analysis of protein kinase C-alpha (PKCα) in Chinese tongue sole (). Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(2): 69–77

CHEN Songlin, E-mail: chensl@ysfri.ac.cn

(編輯 馮小花)