牡蠣皰疹病毒囊膜蛋白(ORF111)的基因克隆及表達(dá)*

張淑敏 白昌明 辛魯生 李亞楠 李 晨 王崇明

牡蠣皰疹病毒囊膜蛋白(ORF111)的基因克隆及表達(dá)*

張淑敏1,2白昌明2辛魯生2李亞楠2李 晨2王崇明2①

(1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 大連 116023；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

本研究對編碼牡蠣皰疹病毒(Ostreid herpesvirus 1, OsHV-1)囊膜蛋白的111基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、克隆和表達(dá)。首先，通過特異性PCR擴(kuò)增得到111基因全長序列，并對其編碼囊膜蛋白的理化性質(zhì)、高級結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)和抗原決定簇等進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，111編碼一種穩(wěn)定的疏水性蛋白，具有5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和9個(gè)抗原決定簇，同時(shí)，氨基酸序列中還包含1個(gè)高度保守的精氨酰–甘氨酰–天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)結(jié)構(gòu)域。隨后，構(gòu)建了pET28a-111重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞中。最后，通過使用異丙基---硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分子量約為32 kDa。本研究應(yīng)用原核表達(dá)得到了含RGD結(jié)構(gòu)域的OsHV-1囊膜蛋白，為進(jìn)一步制備ORF111蛋白單克隆抗體及開展牡蠣皰疹病毒侵染機(jī)制的研究奠定了重要基礎(chǔ)，為將來OsHV-1的防控工作提供新的思路。

牡蠣皰疹病毒；囊膜蛋白；原核表達(dá)；魁蚶

自20世紀(jì)90年代以來，隨著貝類養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，牡蠣皰疹病毒(Ostreid herpesvirus 1, OsHV-1)感染引起的人工養(yǎng)殖貝類大面積死亡在世界范圍內(nèi)頻繁發(fā)生，OsHV-1已成為影響貝類養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要病原微生物之一(Comps, 1977; Renault, 1994a、1994b、1995、1998)。OsHV-1具有典型的皰疹樣病毒粒子特征，由雙鏈DNA構(gòu)成的核心由內(nèi)至外分別由衣殼、被膜(Tegument)及囊膜包裹。OsHV-1基因組DNA大小約200 kbp；衣殼具有正二十面體結(jié)構(gòu)(=16)；被膜由位于核衣殼與囊膜之間的基質(zhì)蛋白組成；囊膜來源于宿主細(xì)胞(磷脂層和膜蛋白)，同時(shí)含有病毒編碼的糖蛋白。OsHV-1是屬(Herpesvirales目, Malacoherpesviridae科)下的唯一種；也是最早被發(fā)現(xiàn)可以感染無脊椎動物的皰疹病毒種(Ren, 2013; Renault, 2000; Le Deuff, 1999; Arzul, 2001; Davidon, 2005)。與脊椎動物皰疹病毒的宿主特異性較高不同，OsHV-1表現(xiàn)出跨種屬感染和流行的致病特點(diǎn)。OsHV-1可以感染多種雙殼貝類，如牡蠣、扇貝、蚶和蛤等，對貝類幼蟲及稚貝的致死率高達(dá)40%~100% (Renault, 2011; Renault, 2012; 張福綏等, 1999; 王運(yùn)濤等, 1999; 宋微波等, 2001)。2012和2013年春季，山東多個(gè)地區(qū)人工養(yǎng)殖的魁蚶()親貝出現(xiàn)大量死亡，通過電鏡在死亡魁蚶中觀察到皰疹樣病毒粒子，后經(jīng)分子生物學(xué)檢測及感染實(shí)驗(yàn)，確定魁蚶種貝的大規(guī)模死亡與牡蠣皰疹病毒感染密切相關(guān)，這也是全球首例在蚶科貝類中發(fā)現(xiàn)的皰疹樣病毒感染(Bai, 2016)。對魁蚶中病毒粒子進(jìn)行純化、基因組測序和序列比對分析，發(fā)現(xiàn)死亡魁蚶中存在的病毒是牡蠣皰疹病毒的新變異株，命名為牡蠣皰疹病毒魁蚶株，簡稱OsHV-1-SB(夏俊洋, 2015)。

對OsHV-1基因組序列進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測顯示，OsHV-1編碼124個(gè)開放閱讀框(Open reading frame, ORF)，其中，38個(gè)ORF編碼膜蛋白。但由于缺乏細(xì)胞系，還難以對上述預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。目前，對OsHV-1預(yù)測ORF的真實(shí)性及其生物學(xué)功能的了解很有限。賈志磊等(2011)和張帥等(2014)僅針對牡蠣皰疹病毒的功能蛋白開展過功能預(yù)測、克隆和原核表達(dá)等研究工作，國際上也僅有1例有關(guān)OsHV-1膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能方面的研究(Martenot, 2019)。根據(jù)對脊椎動物皰疹病毒的研究顯示，皰疹病毒囊膜蛋白具有多種生物學(xué)功能(楊金華等, 2009)，是宿主細(xì)胞進(jìn)行免疫識別的重要抗原表位，也是設(shè)計(jì)和制備抗病毒藥物及疫苗的關(guān)鍵靶標(biāo)(He, 2006)。研究病毒囊膜蛋白對揭示病毒與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制和開發(fā)抗病毒藥物等具有重要的作用。本研究根據(jù)已報(bào)道的牡蠣皰疹病毒及其魁蚶株全基因組序列，成功克隆了預(yù)測為囊膜蛋白的111基因全長序列，并利用生物信息學(xué)方法分析了其編碼蛋白的基本結(jié)構(gòu)特征。最后，經(jīng)原核表達(dá)成功得到了111基因編碼的蛋白產(chǎn)物，為進(jìn)一步制備ORF111單克隆抗體及研究其功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

病料來源于2012年5月23日采集自山東省長島某貝類育苗場的魁蚶種貝，暫養(yǎng)過程中出現(xiàn)雙殼閉合不全、反應(yīng)遲鈍、內(nèi)臟團(tuán)發(fā)白，出現(xiàn)癥狀后1周內(nèi)全部死亡。經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR檢測，這批魁蚶病料中OsHV-1-SB的DNA載量約為106copies/ng總DNA。組織病料在–80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總DNA的提取

將1.1中OsHV-1-SB呈陽性的組織樣品從冰箱中取出后，置于4℃冰箱，過夜解凍，剪取外套膜30 mg，根據(jù)海洋動物總DNA提取試劑盒(天根生化科技公司)說明書上的方法提取總DNA。

1.3 PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室測定完成的OsHV-1-SB全基因組序列，以及其他已公布的OsHV-1變異株基因組序列中111的基因序列，使用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)上下游引物：上游引物111-F：5′-CCGATGA TTGGTCCGATTGTGGTACTAC-3′，其中劃線部分為添加的Ⅰ酶切位點(diǎn)；下游引物111-R：5′-CGCTTATACAATTGGCAGCCATCTTCCT-3′，其中劃線部分為添加的HⅠ酶切位點(diǎn)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 orf111基因的擴(kuò)增

以提取的總DNA為模板，用高保真酶(東洋紡)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 2.5 μl，dNTPs (2 mmol/L) 2.5 μl，MgSO4(25 mmol/L) 1.5 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.75 μl，KOD-Plus- NEO (1 U/μl) 0.5 μl，滅菌水14.5 μl，總體積為25 μl。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；98℃ 10 s，55℃ 30 s，68℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸10 min；PCR產(chǎn)物置于4℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)得到的PCR產(chǎn)物。將擴(kuò)增出的約870 bp的目的片段用DNA瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒(天根生化科技公司)純化回收，并送至金唯智(中國)生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

用Gene tool軟件預(yù)測牡蠣皰疹病毒111基因的氨基酸序列；用NCBI中BLAST工具(http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列比對和相似性分析；用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)工具對該蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測和分析；采用SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號肽預(yù)測；使用TMHMM5.0(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)在線預(yù)測牡蠣皰疹病毒111基因所編碼蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)。采用在線軟件Predicting Antigenic Peptides (http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)及ABCpred(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred)進(jìn)行蛋白抗原特性分析。

1.6 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性核酸內(nèi)切酶HⅠ(NEB)和Ⅰ(NEB)對純化后的目的片段111和原核表達(dá)載體pET28a(+)分別進(jìn)行雙酶切，酶切體系為20 μl：111及pET28a(+)各10 μl，HⅠ1 μl，Ⅰ1 μl，Buffer 2 μl, 滅菌水6 μl，37℃酶切過夜，1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)雙酶切結(jié)果，并切膠回收。將雙酶切后的111目的片段和原核表達(dá)載體pET28a(+)經(jīng)T4 DNA連接酶(NEB)連接，得到重組表達(dá)載體pET28a-111。連接體系為：111酶切產(chǎn)物3 μl，pET28a(+)酶切產(chǎn)物9 μl，T4 DNA連接酶1 μl，Buffer 2 μl，滅菌水5 μl，總體積20 μl，4℃連接過夜。

將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至DH5感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技公司)中，經(jīng)含卡那霉素(Kan+, 50 μg/μl)的LB固體培養(yǎng)基篩選，得到轉(zhuǎn)化成功的表達(dá)菌株，挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。使用質(zhì)粒小量提取試劑盒(天根生化科技公司)提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，同時(shí)，將重組表達(dá)載體送至金唯智(中國)生物科技股份有限公司進(jìn)行測序。將測序正確的重組表達(dá)菌株置于20%甘油，–80℃保存。

1.7 重組表達(dá)載體pET28a-orf111的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組表達(dá)載體pET28a-111接種于LB液體培養(yǎng)基(Kan+, 50 μg/μl)，37℃，200 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)過夜，制備種子液；第2天，按1∶100接種到100 ml LB液體培養(yǎng)基(Kan+, 50 μg/μl)，37℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)至OD600 nm≈0.5~0.6時(shí)，取30 ml作為對照進(jìn)行培養(yǎng)(不進(jìn)行誘導(dǎo))，其余菌液加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h左右，收集菌液，10000×g離心3 min，棄上清液，沉淀中加入1×PBS超聲破碎，10000×g，4℃離心10 min，對照組按照上述方法進(jìn)行破碎；分別收集上清液和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析。上樣前，分別在上清液和沉淀中加入4×SDS上樣緩沖液，金屬浴100℃，5 min，12% SDS-PAGE電泳觀察蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 orf111基因PCR擴(kuò)增及鑒定

以提取的總DNA作為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增獲得相應(yīng)的基因片段，PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在750~1000 bp之間出現(xiàn)了1條特異性條帶，與111基因預(yù)期的目的條帶870 bp大小相符(圖1)。目的條帶測序結(jié)果證實(shí)PCR擴(kuò)增的特異性條帶為目的條帶。

圖1 牡蠣皰疹病毒魁蚶株orf111基因擴(kuò)增

M：DNA marker；111：目的基因Target gene

2.2 orf111基因序列分析

氨基酸序列分析，結(jié)果顯示，牡蠣皰疹病毒魁蚶株的111基因序列中含有1個(gè)精氨酰–甘氨酰–天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)序列(圖2)；經(jīng)SignalP 5.0 Server軟件分析，該氨基酸序列無信號肽；通過TMMHM 5.0在線工具對111基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該蛋白在5~27、107~129、149~ 171、191~213和258~280氨基酸殘基處存在5個(gè)跨膜區(qū)域(圖3)。

2.3 蛋白質(zhì)理化參數(shù)及高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3.1 理化性質(zhì)分析 根據(jù)ProtParam預(yù)測結(jié)果，111基因編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為32.41 kDa，理論等電點(diǎn)為7.00?；蚓幋a的289個(gè)氨基酸中，帶正電荷的堿性氨基酸精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)共26個(gè)，帶負(fù)電荷的酸性氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)共 26個(gè)。該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)和親水性總平均值分別為37.46和0.421，是一種穩(wěn)定的疏水性蛋白質(zhì)。

2.3.2 高級結(jié)構(gòu)預(yù)測 蛋白質(zhì)主鏈通過不同的折疊方式產(chǎn)生由氫鍵維系的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，并由此進(jìn)一步折疊成球形。根據(jù)目前相關(guān)研究，認(rèn)為驅(qū)動蛋白質(zhì)主鏈折疊形成二級結(jié)構(gòu)的動力主要是疏水效應(yīng)。通過SOPMA在線預(yù)測軟件對111基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)主要由4種二級結(jié)構(gòu)元件組成，其中，螺旋占38.41%，轉(zhuǎn)角占4.15%，延伸鏈占26.30%，無規(guī)則卷曲占31.14%。

圖2 牡蠣皰疹病毒魁蚶株orf111基因序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

方框所示序列為RGD三肽

Boxed sequence is the RGD tripeptide

圖3 牡蠣皰疹病毒魁蚶株orf111基因編碼蛋白跨膜區(qū)預(yù)測

經(jīng)在線工具Predicting Antigenic Peptides分析發(fā)現(xiàn)，111基因編碼的蛋白質(zhì)有9處抗原決定簇，分別為4~33、63~76、79~89、102~134、145~177、179~ 189、191~211、222~228、250~280氨基酸殘基，且在63~76、79~89、102~134、145~177區(qū)域及附近存在B細(xì)胞抗原表位的可能性較高，易于與抗體嵌合(張昱等, 2008; 王笑英等, 2010)。

2.4 序列相似性分析

通過NCBI中的BLAST工具進(jìn)行DNA序列相似性分析，結(jié)果表明，牡蠣皰疹病毒魁蚶株111基因與牡蠣皰疹病毒參考株(OsHV-1, AVC68720.1)、急性病毒性壞死病毒(Chlamys acute necrobiotic virus, AVNV, ADD24836.1)、鮑皰疹病毒(Haliotid herpesvirus 1, HaHV-1, YP_006908732)等病毒的111基因有序列相似性。此外，將克隆得到的基因片段翻譯成氨基酸序列，進(jìn)行BLAST后發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)與牡蠣皰疹病毒參考株(OsHV-1)、急性病毒性壞死病毒(AVNV)、鮑皰疹病毒(HaHV-1)也具有序列相似性。其中，111基因的氨基酸序列與牡蠣皰疹病毒111基因的氨基酸序列相似性為99.65%，與急性病毒性壞死病毒ORF111相似性為99.31%，與鮑皰疹病毒ORF80相似性為32.20%。

2.5 重組質(zhì)粒pET28a-orf111菌落PCR和雙酶切鑒定

挑取5~7個(gè)單菌落，分別接種于3 ml不含卡那霉素的LB新鮮液體培養(yǎng)基中，37℃，搖床振蕩培養(yǎng)12 h，以菌液作為模板，進(jìn)行菌落PCR，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示，在750~1000 bp之間靠近1000 bp處出現(xiàn)了特異性條帶，與111基因的大小相符(圖4)。挑取鑒定為陽性的pET28a-111重組菌提取質(zhì)粒，使用Ⅰ及HⅠ限制性核酸內(nèi)切酶，對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，使用1%瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測，結(jié)果與預(yù)期大小相符(圖5)。重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示：目的基因與牡蠣皰疹病毒魁蚶株111基因的DNA序列同源性高達(dá)100%，且所有堿基無缺失、突變。以上結(jié)果表明，重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖4 重組表達(dá)載體pET28a-orf111菌落PCR鑒定

M：DNA marker；1~6：重組質(zhì)粒pET28a-111菌落

Recombinant pET28a-111 bacterial colony

圖5 重組表達(dá)載體pET28a-orf111雙酶切鑒定

M：DNA marker；1：Ⅰ與HⅠ雙酶切產(chǎn)物

pET28a-111 digested withⅠandHⅠ

2.6 重組表達(dá)載體pET28a-orf111的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

在誘導(dǎo)溫度為37℃、IPTG終濃度為1 mmol/L、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為4 h情況下，誘導(dǎo)重組表達(dá)載體pET28a-111蛋白表達(dá)。將誘導(dǎo)表達(dá)的pET28a-111超聲破碎后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，其中沉淀中在30~40 kDa明顯的出現(xiàn)了1條清晰的特異性條帶，約為32 kDa，與目的蛋白大小相符，實(shí)驗(yàn)中未誘導(dǎo)的重組菌上清液、沉淀和誘導(dǎo)的重組菌上清液均無目的條帶(圖6)，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，重組蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中。

3 討論

皰疹病毒侵入宿主細(xì)胞是一個(gè)高度復(fù)雜的過程，涉及鑲嵌在病毒粒子脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)中的多種囊膜蛋白和糖蛋白，以及位于宿主細(xì)胞表面的受體分子。對脊椎動物皰疹病毒感染過程的研究結(jié)果顯示，其侵入過程首先是從病毒與宿主分子或者細(xì)胞的特異性粘附開始，之后，病毒粒子囊膜與宿主細(xì)胞膜融合，使病毒衣殼穿透宿主細(xì)胞(Spear, 2003; Spear, 2004; Agelidis, 2015)。對牡蠣皰疹病毒魁蚶株基因組進(jìn)行的生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，牡蠣皰疹病毒魁蚶株111基因的胞外結(jié)構(gòu)域中存在1個(gè)RGD結(jié)構(gòu)域。RGD結(jié)構(gòu)域不僅是細(xì)胞與基質(zhì)黏附作用和細(xì)胞生長、生存的生理基礎(chǔ)，在介導(dǎo)病毒與細(xì)胞間的黏附過程中也至關(guān)重要(張光輝等, 2010)。內(nèi)源性RGD結(jié)構(gòu)域主要存在于粘附蛋白中，如鐵蛋白、玻連蛋白、血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)、纖維粘連蛋白等，其具有一定的生物活性，能與細(xì)胞表面的整合素受體特異性結(jié)合，是存在于細(xì)胞外基質(zhì)中一段高度保守的結(jié)構(gòu)域(朱麗紅等, 2010; 陳治宇等, 2003; 柴寧莉等, 2012; 張光輝等, 2010; 侯瑞珍等, 2008; 史嘉瑋等, 2005; Kostetski, 2000)。對蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)膜蛋白相關(guān)研究表明，在WSSV病毒感染初期，含RGD結(jié)構(gòu)域的膜蛋白介導(dǎo)了病毒對宿主細(xì)胞膜的粘附，病毒膜蛋白和細(xì)胞受體的粘附作用確實(shí)通過RGD結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)(劉慶慧等, 2005, 林兆宇, 2009; 陳文博, 2009; 唐小千, 2010; 趙建梅, 2013)。王中一等(2018)研究發(fā)現(xiàn)，WSSV入侵凡納濱對蝦細(xì)胞時(shí)，是因?yàn)閂P26和VP37與網(wǎng)格重鏈蛋白相互作用，從而介導(dǎo)WSSV進(jìn)入宿主細(xì)胞中，并加快WSSV病毒在宿主體內(nèi)的一系列活動。由此推測，囊膜蛋白ORF111中的RGD結(jié)構(gòu)域在OsHV-1與宿主細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，在侵染宿主細(xì)胞的過程中都扮演著重要角色。ORF111也是首個(gè)被成功克隆和表達(dá)的含RGD結(jié)構(gòu)域的OsHV-1結(jié)構(gòu)蛋白，對該蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析和原核表達(dá)將有助于理解和研究OsHV-1的侵染機(jī)制。王中一等(2019)通過酵母雙雜交技術(shù)篩選與wsv112互作的宿主蛋白，為研究wsv112的調(diào)控機(jī)制提供新的思路。這一研究成果將對研究膜蛋白ORF111的互作蛋白，及其在病毒侵染宿主過程中的作用機(jī)制提供參考。

圖6 重組表達(dá)載體pET28a-orf111誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的SDS-PAGE

M1、M2：蛋白Marker；1、2：分別為IPTG誘導(dǎo)的重組表達(dá)載體沉淀和上清液；3、4：分別為未誘導(dǎo)重組表達(dá)載體沉淀和上清液

M1, M2: Protein marker; 1: Precipitate protein of recombinant strain induced by IPTG; 2: Supernatant of recombinant strain induced by IPTG; 3: Precipitate of recombinant strain; 4: Supernatant of recombinant strain

在生物的生命活動中膜蛋白起著至關(guān)重要的作用，如能量轉(zhuǎn)換、細(xì)胞增殖和分化、物質(zhì)運(yùn)輸以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，而膜蛋白的功能與其結(jié)構(gòu)息息相關(guān)(Yildirim, 2007)。對病毒囊膜蛋白的序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測，將為后續(xù)開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供幫助。序列比對發(fā)現(xiàn)，牡蠣皰疹病毒魁蚶株111基因編碼蛋白的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中牡蠣皰疹病毒參考株和急性病毒性壞死病毒的111基因編碼蛋白的氨基酸序列相似度分別為99.89%和99.65%，并未發(fā)現(xiàn)其中的氨基酸序列有高變異區(qū)。上述結(jié)果顯示，ORF111蛋白比較保守，這一特點(diǎn)有利于利用該蛋白制備適用于不同牡蠣皰疹病毒變異株的單克隆抗體。對ORF111蛋白的高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列的可變區(qū)存在大量的B細(xì)胞抗原優(yōu)勢表位，這一結(jié)果說明，ORF111蛋白可能具有較好的抗原性(王笑英等, 2010)。B細(xì)胞抗原優(yōu)勢表位與蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)有著緊密聯(lián)系，但目前ORF111蛋白的結(jié)構(gòu)及功能研究尚處于起步階段，所以，本研究通過生物信息學(xué)方法預(yù)測得到的結(jié)果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前，國內(nèi)外僅對OsHV-1功能蛋白開展過誘導(dǎo)表達(dá)和初步結(jié)構(gòu)、功能研究。如開展了基因及基因的克隆、表達(dá)及功能相關(guān)研究(賈志磊等, 2011; 張帥等, 2014)，但對于貝類皰疹病毒囊膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究工作較少，僅Martenot等(2019)對牡蠣皰疹病毒參考株開展了相關(guān)研究。Martenot等(2019)研究表明，牡蠣皰疹病毒參考株25基因編碼的膜蛋白參與了OsHV-1與宿主細(xì)胞的相互作用，ORF25抗體對宿主抗病毒具有促進(jìn)作用。同時(shí)，其研究還表明，病毒與宿主之間的相互作用需要72和41基因編碼的膜蛋白共同參與。根據(jù)牡蠣皰疹病毒25、41和72基因的生物信息學(xué)分析，這3種基因編碼的囊膜蛋白不含RGD結(jié)構(gòu)域。本研究首次以含有RGD結(jié)構(gòu)域的111基因?yàn)檠芯繉ο螅?jīng)基因克隆、表達(dá)載體重組及誘導(dǎo)表達(dá)，成功得到32 kDa的目的蛋白，大小與目的基因111和pET28a(+)原核表達(dá)載體標(biāo)簽序列融合表達(dá)的重組蛋白預(yù)期一致。該結(jié)果為進(jìn)一步研究囊膜蛋白ORF111的功能以及牡蠣皰疹病毒的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為牡蠣皰疹病毒的防控工作提供新的思路。

Agelidis AM, Shukla D. Cell entry mechanisms of HSV: What we have learned in recent years. Future Virology, 2015, 10(10): 1145–1154

Arzul I, Nicolas JL, Davison AJ,. French scallops: A new host for Ostreid herpesvirus-1. Virology, 2001, 290: 342–349

Bai CM, Gao WH, Wang CM,. Identification and characterization of Ostreid herpesvirus 1 associated with massive mortalities ofbroodstocks in China. Diseases of Aquatic Organisms, 2016, 118: 65–75

Chai NL, Xu SP, Shi H,. Arginine-glycin-aspartic acid could enhance oxymatrine liposomes theraputic effect on hepatic fibrosis. Global Traditional Chinese Medicine, 2012, 5(9): 645–650 [柴寧莉, 徐世平, 石卉, 等. 精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸對氧化苦參堿脂質(zhì)體減輕肝纖維化的增強(qiáng)作用研究. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2012, 5(9): 645–650]

Chen WB. Design and evaluation a novel protein vaccine for the precaution of white spot syndrome virus (WSSV) infection. Master′s Thesis of Liaoning Normal University, 2009 [陳文博. 一種預(yù)防白斑綜合癥病毒的新型蛋白疫苗的設(shè)計(jì)和評估. 遼寧師范大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2009]

Chen ZY, Hou J, Wang XF. Synthesis of peptides and analogues containing RGD domain. Journal of Chengde Medical College, 2003, 20(3): 246–247 [陳治宇, 厚今, 王興發(fā). 含RGD序列肽及類似物的合成. 承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2003, 20(3): 246–247]

Comps M, Bonami JR. Infection virale associe a des mortalites chez I′huire. Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances de L'academie des sciences.1977, 285: 1139– 1140

Davidon AJ, Trus BL, Cheng N,. A novel class of herpesvirus with bivalve hosts. Journal of General Virology, 2005, 86(1): 41–53

He JY, Hu HJ, Harrison R,. Transmembrane segments prediction and understanding using support vector machine and decision tree. Expert Systems with Applications, 2006, 30(1): 64–72

Hou RZ, Wang W, Li CR,. Studies on the effects of RGD peptide on the proliferation, adherence and motility of human fibrosarcoma cell HTl080. Journal of Northeast Normal University (Natural Science Edition), 2008, 40(1): 120–124 [侯瑞珍, 王巍, 李春蓉, 等. RGD對人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080增殖、黏附及轉(zhuǎn)移影響的研究. 東北師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2008, 40(1): 120–124]

Jia ZL, Wang CM, Ren WC,. Cloning, expression ofacute viral necrosis virus dUTPase gene and the determination of its enzymatic activity. Journal of Fisheries of China, 2011, 35(9): 1320–1326 [賈志磊, 王崇明, 任偉成, 等. 急性病毒性壞死病毒dUTPase基因的克隆、表達(dá)及其產(chǎn)物的酶學(xué)活性分析. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2011, 35(9): 1320–1326]

Kostetski PV, Artem′ev IV. A conformational analysis of biologically active RGD-containing cyclopeantapeptides. Bioorganicheskaya Khimiya, 2000, 26(4): 290–298

Le Deuff RM, Renault T. Purification and partial genome characterization of a herpes-like virus infecting the Japanese oyster,. Journal of General Virology, 1999, 80(5): 1317–1322

Lin ZY. Characterization of an envelope protein (VP13A) of white spot syndrome virus and the research into the interaction between envelope proteins (VP31 and VP33) and host cells. Master′s Thesis of Xiamen University, 2009 [林兆宇. 對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)膜蛋白VP13A的鑒定及VP31和VP33與宿主細(xì)胞互相作用的初步研究. 廈門大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2009]

Liu QH, Huang J, Han WJ,. Clone and sequence analysis of white spot syndrome virus (WSSV)-VAP1 gene. Journal of Fishery Sciences of China, 2005, 12(3): 352–356 [劉慶慧, 黃倢, 韓文君, 等. WSSV-VAP1基因克隆與序列分析. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2005, 12(3): 352–356]

Martenot C, Faury N, Morga B,. Exploring first interactions between Ostreid herpesvirus 1 (OsHV-1) and its host,: Effects of specific antiviral antibodies and dextran sulfate. Frontiers in Microbiology, 2019, 10: 1128

Ren W, Chen H, Renault T,. Complete genome sequence of acute viral necrosis virus associated with massive mortality outbreaks in the Chinese scallop,. Virology Journal, 2013, 10: 110

Renault T, Cochennec N, Le Deuff RM,. Herpes-like virus infecting Japanese oyster () spat. Bulletin- European Association of Fish Pathologists, l994a, 14(2): 64–66

Renault T, Le Deuff RM, Chollet B,. Concomitant herpes-like virus infections in hatchery-reared larvae and nursery-cultured spatand. Diseases of Aquatic Organisms, 2000, 42(3): 173–183

Renault T, Le Deuff RM, Cochennec N,. Herpes-like viruses associated with high mortality levels in larvae and spat of Pacific oysters,: A comparative study, the thermal effects on virus detection in hatchery-reared larvae, reproduction of the disease in axenic larvae. Veterinary Research, 1995, 26(5–6): 539–543

Renault T, Le Deuff RM, Cochennec N,. Herpesviruses associated with mortalities among Pacific oyster,, in France-comparative study. Revue de Médecine Vétérinaire, 1994b, 145(10): 735–742

Renault T, Lipart C. Diagnosis of herpes-like virus infections in oysters using molecular techniques. European Aquaculture Society Special Publication, 1998, 26: 235–236

Renault T, Moerau P, Faury N,. Analysis of clinical Ostreid herpesvirus 1 (Malacoherpesviridae) specimens by sequenc- ing amplified fragments from three virus genomes areas. Journal of Virology, 2012, 86(10): 5942–5947

Renault T. A review of mortality outbreaks in the Pacific oysters,, reported since 2008 in various Eurpean members states. In: Renault T. The rehted implementation of council directive. Paris. The OIE and its partners, 2011, 5–9

Shi JW, Dong NG. Application of RGD peptide in tissue engineering. Chinese Journal of Experimental Surgery, 2005, 22(9): 1150–1152 [史嘉瑋, 董念國．RGD肽在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2005, 22(9): 1150–1152]

Song WB, Wang CM, Wang XH,. New research progress on massive mortality of cultured scallop. Marine Sciences, 2001, 25(12): 23–26 [宋微波, 王崇明, 王秀華, 等. 櫛孔扇貝大規(guī)模死亡的病原研究新進(jìn)展. 海洋科學(xué), 2001, 25(12): 23–26]

Spear PG, Longnecker R. Herpesvirus entry: An update. Journal of Virology, 2003, 77(19): 10179–10185

Spear PG. Herpes simplex virus: Receptors and ligands for cell entry. Cellular Microbiology, 2004, 6(5): 401–410

Tang XQ. Study on the WSSV receptors in haemocytes of. Doctoral Dissertation of Ocean University of China, 2010 [唐小千. 中國對蝦白斑癥病毒(WSSV)血細(xì)胞受體蛋白的研究. 中國海洋大學(xué)博士研究生學(xué)位論文, 2010]

Wang XY, Du PG, Wu CF,. Bioinformatics analysis of OLFM1 epitope and preparation of polyclonal antibody. Chinese Journal of Immunology, 2010, 26(8): 721–723 [王笑英, 杜培革, 吳春風(fēng), 等. OLFM1蛋白的生物信息學(xué)分析及其多克隆抗體制備與鑒定. 中國免疫學(xué)雜志, 2010, 26(8): 721–723]

Wang YT, Xiang JH. Studies on causation of the mass mortality of. Oceanologia et Limnologia Sinica, 1999, 30(6): 770–774 [王運(yùn)濤, 相建海. 櫛孔扇貝大規(guī)模死亡的原因探討. 海洋與湖沼, 1999, 30(6): 770–774]

Wang ZY, Liu QH, Huang J.interaction between domain of clathrin heavy chain inand WSSV structural proteins. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(2): 138–145 [王中一, 劉慶慧, 黃倢. 凡納濱對蝦網(wǎng)格重鏈蛋白與WSSV結(jié)構(gòu)蛋白在體外的相互作用. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(2): 138–145]

Wang ZY, Liu QH, Lu CY,. Identification of the host interactors of wsv112 of WSSV by yeast two-hybrid. Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(4): 156–162 [王中一, 劉慶慧, 盧翠玉, 等. 利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與wsv112互作的宿主蛋白. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2019, 40(4): 156–162]

Xia JY. Sequence and analysis of the genome of OsHV-1stain. Master′s Thesis of Ocean University of China, 2015, 1–2 [夏俊洋. 牡蠣皰疹病毒魁蚶株基因組測定與分析. 中國海洋大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2015, 1–2]

Yang JH, Ye R. Advances in the viral transmembrane proteins: Structure, function and antiviral drug design. Journal of Microbes and Infection, 2009, 4(4): 231–240 [楊金華, 葉榮. 病毒跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)功能與抗病毒藥物設(shè)計(jì). 微生物與感染, 2009, 4(4): 231–240]

Yildirim MA, Goh KI, Cusick ME,. Drug-target network. Nature Biotechnology, 2007, 25(10): 1119–1126

Zhang FS, Yang HS. Analysis of the sauses of mass mortality of farmingin summer in coastal areas of Shandong, China. Marine Sciences, 1999, 23(1): 44–47 [張福綏, 楊紅生. 山東沿岸夏季櫛孔扇貝大規(guī)模死亡原因分析. 海洋科學(xué), 1999, 23(1): 44–47]

Zhang GH, Yao W, Hao CF,. Inhibitory effect of RGD on silica-induced stimulation in rat lung fibroblast. Modern Preventive Medicine, 2010, 37(11): 2016–2018 [張光輝, 姚武, 郝長付, 等. RGD短肽對二氧化硅致肺成纖維細(xì)胞激活的抑制效應(yīng). 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2010, 37(11): 2016–2018]

Zhang S, Wang CM, Song XL,. Cloning, expression of acute viral necrosis virus IAP-86 gene and studies of its anti-apoptotic mechanism. Journal of Fisheries of China, 2014, 38(2): 274–281 [張帥, 王崇明, 宋曉玲, 等. 急性病毒性壞死病毒IAP-86基因的克隆、表達(dá)及抗凋亡研究. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2014, 38(2): 274–281]

Zhang Y, Wang YL, Zhang YG,. Construction of VP1 and prediction of B cell epitopes from FMDV AF72. Biotechnology Bulletin, 2008(6): 158–163 [張昱, 王永錄, 張永光, 等. 口蹄疫病毒株AF72 VP1的結(jié)構(gòu)構(gòu)建與B細(xì)胞表位預(yù)測. 生物技術(shù)通報(bào), 2008(6): 158–163]

Zhao JM. Identification and characterization of the binding proteins of VP31 and VP110 in Chinese shrimp,. Doctoral Dissertation of Ocean University of China, 2013 [趙建梅. 對蝦白斑癥病毒(WSSV)囊膜蛋白VP31、VP110在中國明對蝦血細(xì)胞和鰓細(xì)胞中結(jié)合蛋白的研究. 中國海洋大學(xué)博士研究生學(xué)位論文, 2013]

Zhu LH, Wu Y, Yuan L,. Effects of immobilized GRGDSPC peptides on proliferation of periodontal ligament fibroblasts on type-1 collagen. Acta Medicinae Universitatis Scientiae et Technologiae Huazhong, 2010, 39(6): 856–859 [朱麗紅, 吳勇, 袁理, 等. RGD七肽固定膠原對人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的影響. 華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2010, 39(6): 856–859]

Gene Cloning and Expression of Ostreid Herpesvirus 1 Envelope Protein (ORF111)

ZHANG Shumin1,2, BAI Changming2, XIN Lusheng2, LI Yanan2, LI Chen2, WANG Chongming2

(1. Department of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116023;2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao Key Laboratory of Mariculture Epidemiology and Biosecurity, Qingdao 266071)

The envelope protein (ORF111) of Ostreid Herpesvirus 1 (OsHV-1) were studied using bioinformatics analysis, gene cloning and expression. Firstly, we designed the primers of the111 gene based on the complete genome sequence of OsHV-1, and successfully cloned the gene. We further analyzed the biological characteristics of the deduced protein sequence encoded by ORF111 gene, which including physicochemical properties, advanced structure, transmembrane region, and antigen determinant cluster. The results showed that the ORF111 protein is a stable hydrophobic protein, which contains nine antigenic determinants, five transmembrane domain structures, and a highly conservative pure ammonia arginyl-glycyl-aspartate (Arg-Gly-Asp, RGD) sequence. Then the OsHV-1-111gene was linked with a pET28a(+) plasmid, and the recombinant plasmid pET28a-111 was successfully constructed. Finally, the recombinant plasmid was transformed into DH5α, and the recombinant protein was expressed after inducing by isopropyl-beta-D-thiogalactosine (IPTG). The SDS-PAGE test showed that the molecular weight of the ORF111 protein was about 32 kDa. In this study, an OsHV-1 envelope protein containing the RGD domain was successfully obtained by prokaryotic expression, which lays a foundation for the preparation of monoclonal antibodies of ORF111, and provides important basis for further study of the infection mechanism of OsHV-1. It also stimulates new ideas for the prevention and control of OsHV-1.

Ostreid herpesvirus 1; Envelope protein; Prokaryotic expression;

S944.4+4

A

2095-9869(2020)02-0183-08

王崇明，研究員，E-mail: wangcm@ysfri.ac.cn

2019-07-09,

2019-07-31

* 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(20603022019022)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-49)共同資助[This work was supported by Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, MARA, Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS (20603022019022), and China Agriculture Research System (CARS-49)]. 張淑敏，E-mail: zhangshumin1223@foxmail.com

10.19663/j.issn2095-9869.20190709001

http://www.yykxjz.cn/

張淑敏, 白昌明, 辛魯生, 李亞楠, 李晨, 王崇明. 牡蠣皰疹病毒囊膜蛋白(ORF111)的基因克隆及表達(dá). 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(2): 183–190

Zhang SM, Bai CM, Xin LS, Li YN, Li C, Wang CM. Gene cloning and expression of Ostreid herpesvirus 1 envelope protein (ORF111). Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(2): 183–190

WANGChongming, E-mail: wangcm@ysfri.ac.cn

(編輯 馬璀艷)