劉安琪 左中夫 吳傳玲 劉學(xué)政

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，是成人視力減退和失明的主要原因[1]。幾乎所有的1型糖尿病患者以及約60%的2型糖尿病患者，在糖尿病確診后15～20 a 均會(huì)出現(xiàn)不同程度的視網(wǎng)膜病變，而且患病率隨著病程延長(zhǎng)而升高[2]。DR是一種多因素疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，主要病理改變包括視網(wǎng)膜血管通透性升高、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)功能障礙、氧化應(yīng)激失衡等[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性慢性炎癥是DR發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，表現(xiàn)為炎癥因子不斷分泌和小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨?，降低炎癥可緩解DR進(jìn)程[4-5]。因此，深入探討炎癥調(diào)節(jié)的上游機(jī)制，尋找關(guān)鍵的作用靶點(diǎn)，能為DR治療提供新的方向。

神經(jīng)突起導(dǎo)向因子Netrin-1是Netrin家族中第一個(gè)被鑒定的成員，是一種層粘連蛋白樣蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期間參與調(diào)節(jié)軸突遷移、海馬形成、神經(jīng)傳導(dǎo)束發(fā)育等過(guò)程[6-7]。除了在神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)外，Netrin-1也廣泛表達(dá)于其他組織器官，包括肺、胰腺、乳腺、腸上皮等。Zhang等[8]利用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型發(fā)現(xiàn)，造模后3個(gè)月視網(wǎng)膜中Netrin-1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著升高；周賢慧等[9-10]進(jìn)一步證實(shí)，給予外源性Netrin-1對(duì)DR具有保護(hù)作用，這主要與外源性Netrin-1降低視網(wǎng)膜血管通透性有關(guān)。但是Miloudi等[11]則認(rèn)為，Netrin-1經(jīng)基質(zhì)金屬蛋白酶9降解后的產(chǎn)物可通過(guò)UNC5B受體增加血管通透性，加重視網(wǎng)膜水腫。因此，Netrin-1對(duì)DR的保護(hù)作用有待進(jìn)一步確定，而且Netrin-1對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎癥因子分泌的影響均不清楚。本研究通過(guò)內(nèi)源性基因沉默后給予外源性Netrin-1蛋白深入探討Netrin-1對(duì)DR大鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型構(gòu)建SD大鼠購(gòu)自于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，均為雄性，體質(zhì)量為(220±30)g。DR大鼠模型的構(gòu)建：造模前大鼠禁食12 h，可自由飲水，按照60 mg·kg-1的劑量腹腔注射10 g·L-1的鏈脲佐菌素溶液，注射后3 d測(cè)量尾靜脈血糖濃度，當(dāng)血糖>16.7 mmol·L-1時(shí)為造模成功，腹腔注射生理鹽水作為對(duì)照[12]。si-NC和si-Netrin-1大鼠的構(gòu)建：造模成功后，采用100 g·L-1的水合氯醛麻醉大鼠，托吡卡胺滴眼液散瞳，使用29G針頭沿角鞏膜緣進(jìn)針，注射10 μL的慢病毒溶液(si-NC和si-Netrin-1)[13]。si-Netrin-1及其陰性對(duì)照si-NC由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，構(gòu)建載體為pGLV3-GFP慢病毒質(zhì)粒，si-Netrin-1序列為：5’-GGAAGTTCACGGTGAACAT-3’，si-NC序列為：5’-GATGAGGCTAGAACTACTG-3’[14]。

1.1.2 試劑及儀器鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司)，Netrin-1(美國(guó)R&D Systems公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司)，抗Iba1抗體(英國(guó)Abcam公司)，山羊血清封閉液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)分組共進(jìn)行兩組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，分別為：(1)為了研究Netrin-1基因沉默對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜損傷的影響，使用si-NC和si-Netrin-1大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將大鼠分為4組：A組(si-NC大鼠)、B組(si-Netrin-1大鼠)、C組(si-NC大鼠+DR造模)、D組(si-Netrin-1大鼠+DR造模)。(2)為了研究外源性Netrin-1對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜損傷的影響，使用WT大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為3組：對(duì)照組、DR組、Netrin-1組，Netrin-1組在DR造模成功后1個(gè)月時(shí)玻璃體內(nèi)注射Netrin-1溶液(500 mg·L-1，5 μL)[9]。上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每組均6只，并且均在造模成功后3個(gè)月時(shí)取視網(wǎng)膜組織進(jìn)行檢測(cè)。本研究遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》(2017修訂版)的規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 HE染色檢測(cè)視網(wǎng)膜組織各層的厚度常規(guī)制作視網(wǎng)膜組織冰凍切片，PBS洗滌后使用蘇木精染色，鹽酸酒精分化，再使用酚紅染色和二甲苯透明，中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照，使用Image J軟件測(cè)量視網(wǎng)膜組織各層厚度，包括內(nèi)叢狀層(inner plexiform layer，IPL)、內(nèi)核層(inner nuclear layer，INL)、外叢狀層(outer plexiform layer，OPL)、外核層(outer nuclear layer，ONL)。

1.2.2 免疫熒光染色檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中Iba1表達(dá)情況常規(guī)制作視網(wǎng)膜組織冰凍切片，PBS漂洗3次，每次5 min，用固定液固定10 min，然后使用體積分?jǐn)?shù)0.1%的Triton X-100浸泡20 min，滴加山羊血清封閉液封閉30 min，滴加抗Iba1抗體(1100)，于4 ℃過(guò)夜孵育。PBS漂洗3次，滴加FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫孵育2 h，PBS漂洗3次，滴加含DAPI的封片劑，封片后置于熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)炎癥因子表達(dá)情況采用Trizol法提取視網(wǎng)膜組織中的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參基因。引物序列合成于蘇州金唯智生物科技有限公司，具體序列為：白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)上游引物：5’-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3’，下游引物：5’-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3’；白細(xì)胞介素-6(IL-6)上游引物：5’-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3’，下游引物：5’-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3’；白細(xì)胞介素-12(IL-12)上游引物：5’-CAATCACGCTACCTCCTCTTTT-3’，下游引物：5’-CAGCAGTGCAGGAATAATGTTTC-3’；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)上游引物：5’-CAGGCGGTGCCTATGTCTC-3’，下游引物：5’-CGATCACCCCGAA-GTTCAGTAG-3’。使用2-△△Ct法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，將對(duì)照組或si-NC組目的基因的相對(duì)表達(dá)量作為1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所有計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)量數(shù)據(jù)兩組間的比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Netrin-1基因沉默對(duì)視網(wǎng)膜組織中IPL、INL、OPL、ONL厚度的影響HE染色結(jié)果顯示，C組和D組視網(wǎng)膜組織中IPL、INL、OPL、ONL厚度均薄于A組和B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；而且，D組INL、ONL厚度薄于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，見表1和圖1。

2.2 Netrin-1基因沉默對(duì)視網(wǎng)膜組織中Iba1表達(dá)的影響免疫熒光染色結(jié)果顯示，C組和D組視網(wǎng)膜組織中Iba1表達(dá)呈現(xiàn)的熒光強(qiáng)度明顯高于A組和B組，而且D組高于C組。見圖2。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜各層組織厚度的比較

組別IPL厚度/μmINL厚度/μmOPL厚度/μmONL厚度/μmA組32.38±1.65 29.71±1.15 9.77±0.67 42.57±1.35 B組32.14±2.5829.25±1.669.25±0.7941.75±2.03C組24.73±1.10ab22.57±0.63ab6.36±0.51ab39.38±1.65abD組23.85±1.29ab21.14±1.03abc6.03±0.82ab36.62±1.21abcF值41.74085.65044.59016.940P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與A組相比，aP<0.05；與B組相比，bP<0.05；與C組相比，cP<0.05

圖1 HE染色檢測(cè)視網(wǎng)膜組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)(×400)

圖2 免疫熒光染色檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中Iba1的表達(dá)

2.3 Netrin-1基因沉默對(duì)視網(wǎng)膜組織中炎癥因子表達(dá)的影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，C組和D組視網(wǎng)膜組織中IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α mRNA表達(dá)水平均高于A組和B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；D組各炎癥因子表達(dá)均高于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中炎癥因子的表達(dá)水平

組別IL-1βIL-6IL-12TNF-αA組1.00±0.18 1.00±0.17 1.00±0.15 1.00±0.13 B組1.09±0.231.04±0.140.95±0.111.06±0.18C組5.37±0.52ab4.02±0.59ab3.90±0.36ab4.02±0.50abD組6.80±0.61abc4.88±0.55abc4.77±0.48abc6.83±0.59abcF值290.500138.900236.600287.500P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與A組相比，aP<0.05；與B組相比，bP<0.05；與C組相比，cP<0.05

2.4 外源性Netrin-1對(duì)視網(wǎng)膜組織中IPL、INL、OPL、ONL厚度的影響HE染色結(jié)果顯示，DR組和Netrin-1組視網(wǎng)膜組織中IPL、INL、OPL、ONL厚度均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；而且，Netrin-1組INL、ONL厚度高于DR組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見圖3和表3。

2.5 外源性Netrin-1對(duì)視網(wǎng)膜組織中Iba1表達(dá)的影響免疫熒光染色結(jié)果顯示，Netrin-1組視網(wǎng)膜組織中Iba1表達(dá)呈現(xiàn)的熒光強(qiáng)度明顯低于DR組。見圖4。

圖3 HE染色檢測(cè)視網(wǎng)膜組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)(×400)

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜各層組織厚度的比較

組別IPL厚度/μmINL厚度/μmOPL厚度/μmONL厚度/μm對(duì)照組32.51±0.81 29.18±0.67 9.85±0.44 43.21±1.07 DR組24.43±1.16a23.63±0.78a6.56±0.86a38.50±1.26aNetrin-1組25.19±1.07a25.51±1.04ab7.03±0.92a40.28±1.83abF值113.90067.05032.03016.740P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與DR組相比，bP<0.05

圖4 免疫熒光染色檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中Iba1的表達(dá)

2.6 外源性Netrin-1對(duì)視網(wǎng)膜組織中炎癥因子表達(dá)的影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Netrin-1組視網(wǎng)膜組織中IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α mRNA表達(dá)水平均低于DR組，高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見表4。

表4 各組視網(wǎng)膜組織中炎癥因子的表達(dá)水平

組別IL-1βIL-6IL-12TNF-α對(duì)照組1.00±0.16 1.00±0.13 1.00±0.16 1.00±0.19 DR組5.28±0.53a3.88±0.41a4.36±0.35a6.24±0.64aNetrin-1組2.66±0.49ab2.71±0.44ab2.80±0.40ab4.35±0.50abF值153.30099.740165.200182.200P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與DR組相比，bP<0.05

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，炎癥在DR的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，使用抗炎藥物可阻止其發(fā)生發(fā)展；IL-1β、TNF-α等炎癥因子在DR患者的外周血、玻璃體中的表達(dá)量明顯升高[15]。炎癥可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞間黏附分子-1、P選擇素等，誘導(dǎo)白細(xì)胞在血管內(nèi)皮的黏附和遷移，大量釋放各種炎癥因子，破壞內(nèi)皮細(xì)胞間的連接與屏障功能[16]。Netrin-1是一種新型的抗炎因子，在各種疾病中發(fā)揮抗炎作用，如Mirakaj等[17]發(fā)現(xiàn)急性肺損傷可導(dǎo)致肺組織Netrin-1表達(dá)顯著降低，給予外源性Netrin-1可抑制中性粒細(xì)胞遷移和炎癥因子釋放。我們推測(cè)Netrin-1可能通過(guò)抗炎機(jī)制在糖尿病視網(wǎng)膜損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

為了檢測(cè)內(nèi)源性Netrin-1在DR進(jìn)展中的作用，本研究使用RNA干擾技術(shù)沉默Netrin-1表達(dá)，造模3個(gè)月后對(duì)視網(wǎng)膜組織進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示D組INL、ONL厚度薄于C組，表明Netrin-1基因沉默可進(jìn)一步加重視網(wǎng)膜損傷。對(duì)視網(wǎng)膜組織中各炎癥因子的表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Netrin-1基因沉默可導(dǎo)致炎癥因子表達(dá)進(jìn)一步升高。上述結(jié)果表明，內(nèi)源性的Netrin-1表達(dá)在DR中發(fā)揮保護(hù)作用，但是RNA干擾技術(shù)仍然存在抑制效率不高等不足，未來(lái)仍需要使用Netrin-1基因敲除動(dòng)物驗(yàn)證該結(jié)論。此外，在DR造模后1個(gè)月通過(guò)玻璃體內(nèi)注射Netrin-1，結(jié)果顯示外源性Netrin-1可以緩解DR導(dǎo)致的INL、ONL厚度降低，抑制各炎癥因子表達(dá)，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

小膠質(zhì)細(xì)胞是視網(wǎng)膜中的免疫細(xì)胞，在生理狀態(tài)下一般處于靜息狀態(tài)，具有吞噬細(xì)胞碎片、抗原提呈、分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、組織修復(fù)等功能，但是在高糖刺激下則會(huì)持續(xù)活化，分泌大量的炎癥毒性因子，損傷神經(jīng)及血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞視網(wǎng)膜內(nèi)皮屏障功能，加重病理?yè)p傷[18]。Iba1是一種鈣結(jié)合蛋白，特異性表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞，而且在小膠質(zhì)細(xì)胞活化時(shí)其表達(dá)量顯著升高，因此檢測(cè)Iba1表達(dá)水平可反映小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況。本研究對(duì)Iba1進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示Netrin-1基因沉默可上調(diào)Iba1表達(dá)，而外源性給予Netrin-1蛋白則可降低其表達(dá)，表明Netrin-1可抑制DR導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞活化。

研究發(fā)現(xiàn)，Netrin-1可通過(guò)A2BAR受體結(jié)合發(fā)揮抗炎作用，如Mirakaj等[19]在急性腹膜炎小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，外源性給予Netrin-1可以降低腹膜滲出液的炎癥因子含量，抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但是在A2BAR受體敲除小鼠中則無(wú)法發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。此外，也有研究報(bào)道Netrin-1可通過(guò)其他類型受體發(fā)揮生物學(xué)作用，包括UNC5同源物、整合素α6β4和整合素α3β1等[20]。然而，這些受體是否參與Netrin-1在DR中的保護(hù)作用尚不清楚，未來(lái)需要對(duì)此進(jìn)行更為深入地探討。

綜上所述，Netrin-1基因沉默可加重糖尿病大鼠視網(wǎng)膜損傷和炎癥，外源性Netrin-1則具有保護(hù)作用。