蔡鳳嬌，蔣燕明，宋慶迎，汪江波

（湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068）

葛根（Pueraria lobata）是豆科植物野葛和甘葛藤羅的塊根，是中國南方一些省份的常用食材，主要產于湖北、廣西、廣東、江西等地區(qū)。葛根富含淀粉，含有人體必需的8種氨基酸和鐵、鈣、鋅、鍺等礦物質元素[1-3]。黃酮類化合物具有清除自由基、擴張血管、降低血壓和防止動脈硬化、改善血液循環(huán)、避免細胞低氧傷害的功能，有解酒功效[4]。酸乳是經乳酸菌在一定條件下發(fā)酵而成的有活性微生物的有益飲品，也是一種微生態(tài)調節(jié)劑，可恢復腸道微生態(tài)環(huán)境[5-8]。酒精代謝容易導致人體內的代謝紊亂，而酸乳中含有的大量的氨基酸可以幫助其進行調節(jié)，酸乳被大量應用在食品中[9-12]。葛根酸乳的研發(fā)不僅能得到一種營養(yǎng)價值豐富的乳飲品，還為葛根的深度開發(fā)利用提供了一種新途徑，同時在飲品中添加酸乳是目前的發(fā)展趨勢[13-14]。黃誠等[15]對葛根原料護色處理，復合穩(wěn)定劑配比，加工過程進行單因素分析，并結合感官評定得到一種優(yōu)化葛根酸乳。馬靜等[16]總結了發(fā)酵溫度、pH值、發(fā)酵時間等因素對乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）產量的影響，但是沒有將其應用在葛根發(fā)酵乳中。本試驗以試驗室篩選的一株高產胞外多糖的乳酸菌為發(fā)酵菌株，以總黃酮含量和乳酸菌胞外多糖含量為評價指標來優(yōu)化葛根發(fā)酵乳工藝，以期得到一種營養(yǎng)價值豐富的葛根發(fā)酵乳。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵菌株：湖北工業(yè)大學釀酒研究所從酸奶中篩選的產胞外多糖的乳酸菌。菌種鑒定為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus，L.b）和唾液鏈球菌嗜熱亞種（Streptococcus salivariussubsp.thermophilus，S.t）。

酸奶：市售；脫脂奶粉：內蒙古蒙牛乳業(yè)股份有限公司；葛根：產于湖北荊門（超市購買）；蘆?。好绹鳤cros Organic公司；石油醚、NaOH、Al（NO3）3、Al2（SO4）3、Na2NO2、K2HPO4、檸檬酸二銨、乙酸鈉、葡萄糖、吐溫-80、MgSO4·7H2O、MnSO4（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。耐高溫α-淀粉酶（20 000 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）：山東蘇柯漢生物工程股份有限公司。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO40.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4。

1.2 儀器與設備

DRP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信試驗儀器有限公司；JMR-117型pH計：北京菁美瑞科技有限公司；XSP-9CA型光學顯微鏡：上海光學儀器廠；L8（762）紫外分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；GJB100-120三柱塞均質機：常州地利人和均質機有限公司；BPP-7800 pH計：貝爾分析儀器（大連）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葛根發(fā)酵乳工藝流程及操作要點

將葛根洗干凈，去皮切塊，加蒸餾水打漿使葛根質量分數為10%，過濾，加10 U/g葛根質量的淀粉酶85～90 ℃糊化2h，冷卻至60～65℃加200U/g葛根質量的糖化酶糖化2h。

脫脂乳過濾、均質，殺菌、冷卻到35 ℃以下后與葛根糖化液按一定比例混合。

添加葡萄糖，調整脫脂乳、葛根糖化液混合物初始pH值為5.7～6.9，121 ℃滅菌15 min。

將菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。按脫脂乳∶葛根糖化液=2∶1（V/V）的比例配成種子培養(yǎng)液，將在MRS液體培養(yǎng)基中活化好的菌液接種0.2%到種子培養(yǎng)液中，在40 ℃條件下厭氧培養(yǎng)16 h，得到種子液。

再將種子液按一定比例接種到葛根脫脂乳混合液中在40 ℃厭氧發(fā)酵20 h。

1.3.2 發(fā)酵菌株的確定及其生長曲線的測定

按10%脫脂乳∶10%葛根糖化液=1∶1（V/V）配制培養(yǎng)基，自然pH，分別以3%接種量接種，在40 ℃厭氧的條件下培養(yǎng)20 h，發(fā)酵結束后檢測葛根總黃酮和乳酸菌EPS，選擇葛根總黃酮和乳酸菌EPS含量最高的菌株為本試驗的發(fā)酵菌株。

脫脂乳：葛根液分別按照1∶1、1∶2、2∶1（V/V）配制培養(yǎng)基，自然pH。將上述確定的菌株以3%的接種量分別接種于各培養(yǎng)基，在40 ℃厭氧條件下培養(yǎng)30 h，間隔5 h取樣涂布于平皿上計數，同時測定發(fā)酵液pH值，繪制各培養(yǎng)基中乳酸菌的生長曲線，確定培養(yǎng)基的組分。

1.3.3 葛根發(fā)酵乳發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗

確定其他因素不變，進行單因素試驗，每一個單因素所得出的結果用于后續(xù)試驗。分別調整發(fā)酵溫度為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃；發(fā)酵液初始pH值為5.7、6.1、6.3、6.6、6.9；接種量為1%、2%、3%、4%、5%；葡萄糖添加量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；發(fā)酵時間為14 h、17 h、20 h、23 h、26 h。測定發(fā)酵結束后的葛根總黃酮和EPS含量。

1.3.4 葛根發(fā)酵乳發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以葛根總黃酮（Y1）和EPS含量（Y2）為響應值，選取影響較大的因素即發(fā)酵溫度（X1）、發(fā)酵時間（X2）和葡萄糖添加量（X3）設計響應面優(yōu)化試驗，因素與水平如表1。

表1 葛根發(fā)酵乳發(fā)酵條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization of fermented pueraria-milk

1.3.5 測定方法

總黃酮測定方法：分光光度法[17]；胞外多糖（EPS）測定方法：硫酸-苯酚法[18]。生長曲線測定方法：間隔5 h取樣涂布于MRS固體培養(yǎng)皿上計數；pH值測定方法：用pH計測定發(fā)酵液pH。

1.3.6 統計分析

采用SAS9.2統計軟件分析其響應面回歸數據及因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵菌株的確定及生長曲線測定

2.1.1 發(fā)酵菌株的確定

將篩選的一株德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）和一株唾液鏈球菌嗜熱亞種（Streptococcus salivariussubsp.thermophilus）分別發(fā)酵和1∶1組合發(fā)酵，測得葛根總黃酮和EPS含量如表2所示。由表2可，嗜熱鏈球菌（S.t）的葛根總黃酮和EPS含量相對較高。因此，將其作為發(fā)酵菌株。

表2 各菌株發(fā)酵液中總黃酮和胞外多糖產量Table 2 Yield of total flavonoids and exopolysaccharides in fermentation broth of each strain

2.1.2 培養(yǎng)基確定及乳酸菌生長曲線的測定結果

由圖1、2、3可知，脫脂乳∶葛根液為1∶2（V/V）時，乳酸菌活菌數在15 h左右＞0.4×109個/mL，而其他兩組培養(yǎng)基，乳酸菌在整個發(fā)酵期間內活菌數均＜0.4×109個/mL。發(fā)酵液pH在發(fā)酵中后期幾乎保持穩(wěn)定。所以培養(yǎng)基中脫脂乳與葛根液比例為1∶2（V/V）時，嗜熱鏈球菌生長最好。

圖1 脫脂乳∶葛根體積比1∶2時pH變化及嗜熱鏈球菌生長曲線Fig.1 pH change and growth curve of Streptococcus thermophilus cultured with skim milk and pueraria volume ratio 1∶2

圖2 脫脂乳∶葛根體積比1∶1時pH變化及嗜熱鏈球菌生長曲線Fig.2 pH change and growth curve of Streptococcus thermophilus cultured with skim milk and pueraria volume ratio 1∶1

圖3 脫脂乳：葛根體積比2:1時pH變化及嗜熱鏈球菌生長曲線Fig.3 pH change and growth curve of Streptococcus thermophilus cultured with skim milk and pueraria volume ratio 2:1

2.2 葛根發(fā)酵乳發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵溫度對葛根發(fā)酵乳的影響

由圖4可知，隨發(fā)酵溫度升高，葛根總黃酮和EPS含量均是先增后減，在40 ℃時達到最高。葛根總黃酮含量最高達1.60 mg/mL，EPS含量最高達0.120 mg/mL。通過單因素差異顯著性分析得到發(fā)酵溫度對葛根總黃酮含量的影響顯著性P1=0.000＜0.01，溫度對EPS含量的影響顯著性P2=0.000＜0.01，說明發(fā)酵溫度對葛根發(fā)酵乳發(fā)酵影響極顯著。

圖4 發(fā)酵溫度對發(fā)酵液中葛根總黃酮和胞外多糖含量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on total flavonoids and exopolysaccharides content in fermentation broth

2.2.2 初始pH值對葛根發(fā)酵乳的影響

由表3可知，發(fā)酵液初始pH值對葛根總黃酮含量的影響不大，尤其是在6.0～6.9變化時，葛根總黃酮最終含量差距甚微。不同的初始發(fā)酵液pH值，其胞外多糖最終含量差距較大，且初始pH值為6.3時，對嗜熱鏈球菌胞外多糖的合成比較有利。通過單因素差異顯著性分析得到初始pH值對葛根總黃酮含量的影響顯著性P1=0.06＞0.05，初始pH值對EPS含量的影響顯著性P2=0.051＜0.05，說明初始pH值對葛根發(fā)酵乳發(fā)酵的影響不顯著。

表3 不同初始pH值對發(fā)酵液中葛根總黃酮和胞外多糖含量的影響Table 3 Effect of different initial pH on total flavonoids and exopolysaccharides content in fermentation broth

2.2.3 接種量對葛根發(fā)酵乳的影響

圖5 不同接種量對葛根總黃酮和胞外多糖含量的影響Fig.5 Effect of different inoculum on total flavonoids and exopolysaccharides contents in fermentation broth

由圖5可知，葛根總黃酮含量隨乳酸菌添加量的增加而逐漸升高。乳酸菌接種量為3%、4%、5%時，葛根總黃酮含量幾乎保持不變，含量依次為1.50 mg/mL、1.51 mg/mL、1.57 mg/mL。EPS含量隨著乳酸菌接種量的增加先升高后基本保持穩(wěn)定，接種量為3%時，EPS含量最大，達到0.120 mg/mL。雖然乳酸菌接種量5%時的葛根總黃酮含量略高，但從節(jié)約成本角度講，選擇乳酸菌接種量為3%。

通過單因素差異顯著性分析得到接種量對葛根總黃酮含量的影響顯著性P1=0.1＞0.05，接種量對EPS含量的影響顯著性P2=0.052＞0.05，說明接種量對葛根發(fā)酵乳發(fā)酵的影響不顯著。

2.2.4 葡萄糖添加量對葛根發(fā)酵乳的影響

很多研究表明，當乳酸菌以葡萄糖為碳源時可以得到最高的胞外多糖產量[19-20]。因此探究葡萄糖添加量對其EPS和葛根黃酮含量也很重要。葡萄糖添加量為添加的葡萄糖質量占葛根脫脂乳質量的百分數。

圖6 葡萄糖添加量對葛根總黃酮和胞外多糖含量的影響Fig.6 Effect of glucose addition on total flavonoids and exopolysaccharides contents in fermentation broth

由圖6可知，隨著葡萄糖添加量的增加，EPS和葛根總黃酮含量均是先上升后下降，且葡萄糖添加量為1.5%時，兩者含量都達到最大值，分別為2.00 mg/mL和0.160 mg/mL。通過單因素差異顯著性分析得到葡萄糖添加量對葛根總黃酮含量的影響顯著性P1=0.004＜0.01，葡萄糖添加量對EPS含量的影響顯著性P2=0.000＜0.01，說明葡萄糖添加量對葛根發(fā)酵乳發(fā)酵的影響極顯著。

2.2.5 發(fā)酵時間對葛根發(fā)酵乳的影響

圖7 發(fā)酵時間對葛根總黃酮和胞外多糖含量的影響Fig.7 Effect of the fermentation time on total flavonoids and exopolysaccharides contents in fermentation broth

由圖7可知，葛根總黃酮含量和EPS含量在發(fā)酵時間為14～26 h之間都先上升后降低，在發(fā)酵20 h后保持平緩的趨勢。發(fā)酵時間為20 h時，葛根總黃酮含量為1.78 mg/mL，EPS含量達到最大為0.160 mg/mL。葛根總黃酮在23 h達到最大為1.85 mg/mL，此時EPS含量為0.160 mg/mL。通過單因素差異顯著性分析得到發(fā)酵時間對葛根總黃酮含量的影響顯著性P1=0.012＜0.05，發(fā)酵時間對EPS含量的影響顯著性P2=0.000＜0.01，說明發(fā)酵時間對葛根發(fā)酵乳發(fā)酵的影響顯著。

2.2.5 Box-Behnken試驗設計及回歸分析

由單因素試驗可知，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、葡萄糖添加量對EPS和葛根總黃酮含量影響較大，因此選此3因素進行響應面優(yōu)化試驗，再根據各因素的試驗結果選取3個水平。

Box-Behnken試驗結果與分析見表4，方差分析見表5和表6。

表4 Box-Behnken試驗設計及結果Table 4 Design and results Box-Behnken experiments

表5 以葛根總黃酮為評價指標的響應面試驗方差分析Table 5 Variance analysis of response surface using total flavonoids of pueraria as evaluation index

表6 以胞外多糖為評價指標的響應面試驗方差分析Table 6 Variance analysis of response surface using exopolysaccharides of pueraria as evaluation index

2.2.6 葛根總黃酮含量的響應面分析

圖8 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、葡萄糖添加量交互作用對葛根總黃酮含量影響的響應曲面及等高線Fig.8 Response surface and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,time and glucose addition on total flavonoids contents of pueraria

由圖8可知，當葡萄糖添加量為1.5%時，隨著溫度的升高，葛根總黃酮含量先升后降，當溫度為40.29 ℃，培養(yǎng)時間為22.68 h時，葛根總黃酮含量最大。X2=22 h時，X1在37～40.29 ℃范圍內，X3=1.41%時，葛根總黃酮含量最大。X1=40 ℃時，葡萄糖添加量＜1.41%時，葛根總黃酮含量隨時間的延長先增大后減少，在培養(yǎng)時間為22.68 h時最大。

采用SAS9.2統計軟件分析，得X1=0.0932 5，X2=0.223 67，X3=-0.179 83為最優(yōu)水平代碼，即最佳發(fā)酵條件為：葡萄糖添加量為1.4%，發(fā)酵時間22.68 h，發(fā)酵溫度40.29 ℃，理論上葛根總黃酮的產量為1.959 478 mg/mL。進行驗證試驗，采用響應面分析得出的最優(yōu)條件進行發(fā)酵試驗，設三個平行試驗，葛根總黃酮的平均值為1.95 mg/mL，與理論預測值誤差較小。

2.2.7 胞外多糖含量的響應面分析

圖9 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、葡萄糖添加量對胞外多糖含量影響的響應曲面及等高線Fig.9 Response surface and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,time and glucose addition on exopolysaccharides contents of pueraria

由圖9可知，X3=1.5%時，溫度在37～38.7 ℃范圍內，當培養(yǎng)時間為19.8 h時，胞外多糖產量最大。當溫度超過38.7 ℃時，其響應面曲線呈現陡峭趨勢，隨著溫度的升高，胞外多糖含量降低。當溫度超過38.7 ℃時，乳酸菌細胞增殖快。而合成細胞壁和EPS都需要消耗磷酸類異戊二烯[21-22]，因此EPS的含量就會隨之降低。X2=22 h時，X3在1%～1.38%范圍內，溫度高為38.7 ℃時，EPS的含量最大。當X3＞1.38%時，EPS的含量急劇降低，這是因為X3＞1.38%時，嗜熱鏈球菌的生長和代謝由于葡萄糖效應的產生而受到了抑制[21]。當X1=40 ℃時，X3在1%～1.38%范圍內，隨著X2增大，EPS含量逐漸增大，當X2=25 h左右達到最高值。

葡萄糖添加量和溫度對EPS含量的影響要大于培養(yǎng)時間的影響。經分析，得到最優(yōu)化水平代碼X1=-0.456 37，X2=-0.735 87，X3=-0.233 59，即葡萄糖添加量為1.38%，培養(yǎng)溫度38.7 ℃，發(fā)酵時間19.8 h，理論上EPS產值可達0.159 69 mg/mL。進行驗證試驗，采用響應面分析得出的最優(yōu)條件進行發(fā)酵試驗，設三個平行試驗，EPS含量為0.155 mg/mL，與理論預測值誤差較小。

2.2.8 嗜熱鏈球菌發(fā)酵條件的綜合分析

從表5、表6中可知，發(fā)酵溫度F1（20）＜發(fā)酵溫度F2（98），葡萄糖添加量F1（174）＜葡萄糖添加量F2（288），由此可知，這兩個因素對EPS產率的影響大于對葛根總黃酮的影響。綜合考慮，確定葡萄糖添加量為1.4%，發(fā)酵溫度為39 ℃。由表5可知，發(fā)酵時間的P＞0.05，即發(fā)酵時間對葛根總黃酮影響不顯著，因此選擇較短的時間20 h。

添加1.4%的葡萄糖，在39 ℃發(fā)酵唾液鏈球菌嗜熱亞種20 h，發(fā)酵結束后測定葛根總黃酮和EPS含量，分別為（1.91±0.1）mg/mL、（0.155±0.02）mg/mL。

3 結論

試驗從酸乳中篩選獲得一株產胞外多糖的嗜熱鏈球菌，且脫脂乳和葛根糖化液體積比例為1∶2時，此菌生長情況最好，這可能是葛根中含有對嗜熱鏈球菌生長具有促進作用的某種生長因子。嗜熱鏈球菌的最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度為39 ℃，發(fā)酵時間為20 h，葡萄糖添加量為1.4%。在此優(yōu)化條件下，葛根發(fā)酵乳總黃酮含量為1.91 mg/mL，EPS含量為0.155 mg/mL。