張霽紅，康三江，曾朝珍，李玉梅，張海燕

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省果蔬貯藏加工技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730070）

蘋果醋含有豐富的有機酸[1]、氨基酸[2]、多酚類[3]、維生素[4]等物質(zhì)，具有良好的營養(yǎng)、保健作用。有機酸是果醋酸味的主要來源，氨基酸能夠豐富果醋的風(fēng)味與營養(yǎng)[5]，酚類物質(zhì)與蘋果醋的營養(yǎng)價值密不可分，研究表明蘋果醋中豐富的多酚類物質(zhì)，既具有預(yù)防癌癥、高血壓、心臟病等作用，也可保護維生素C不被破壞從而使膽固醇含量降低[6]。

玫瑰水提物中含有豐富的玫瑰花色素和芳香類物質(zhì)，玫瑰花色素是一種天然食用色素，包括沒食子單寧類、鞣花單寧類、橡黃素、天然葵色素等[7]，花色素是藥用價值很高的天然強效自由基清除劑，具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防和治療心血管疾病、抑菌等多種藥用功能[8-9]。

采用蘋果醋、玫瑰水提物為主料制得的蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料，香氣濃郁、顏色鮮艷，口感酸甜且有很高的營養(yǎng)價值。目前國內(nèi)研究主要集中在單一果醋的研究開發(fā)方面，而對復(fù)合果醋飲料的營養(yǎng)保健功能研究較少。本實驗分析檢測蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料中的有機酸、游離氨基酸和基本營養(yǎng)素等物質(zhì)成分，研究酚類物質(zhì)含量及其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的能力，并與單一蘋果醋飲料的抗氧化性能進行比較，旨在為蘋果玫瑰醋飲料營養(yǎng)成分和抗氧化性能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果：甘肅省靜寧縣；玫瑰：蘭州市永登縣苦水鎮(zhèn)；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）CICC20056：中國微生物菌種保藏中心；蔗糖、濃縮蘋果汁（可溶性固形物70%）（均為食品級）：市售。

亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、磷酸二氫鈉、甲醇、磷酸、鹽酸、異硫氰酸苯酯、氫氧化鈉、檸檬酸、正丁醇、乙酸乙酯、鄰苯三酚、Tris-HCl、硫酸亞鐵、水楊酸、DPPH、乙醇等試劑（均為分析純）：上海晶純生化科技股份有限公司；乙酸、酒石酸、草酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、琥珀酸、沒食子酸、香草酸、咖啡酸、阿魏酸、兒茶酚、槲皮苷、蘆丁等標準品（均為色譜純）：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

UV 2400紫外可見分光光度計：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；BSA224S-CW電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；TGL-16 MC冷凍離心機：長沙維爾康湘鷹離心機有限公司；PAL-1數(shù)顯糖度計：日本愛拓數(shù)顯糖度計；HH-S4電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀：美國安捷倫儀器公司；Rigol L3000高效液相色譜儀：蘇州普源精電科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蘋果玫瑰復(fù)合醋飲料制備工藝

1.3.2 操作要點

（1）飲料用蘋果醋制備：選用新鮮完好無腐爛、病蟲害的蘋果，清洗榨汁，調(diào)整果汁可溶性固形物含量至14°Bx后，接種蘋果汁總質(zhì)量8%的活化果酒酵母，25 ℃酒精發(fā)酵7 d，糖度不再下降時，接種蘋果汁總質(zhì)量10%的巴氏醋桿菌，32 ℃醋酸發(fā)酵8 d，殺菌、陳釀后得到飲料用蘋果醋，總酸含量≥4%。

（2）玫瑰提取液的制備：將玫瑰花蕾粉與水混合（玫瑰花蕾粉的質(zhì)量和水的體積比為1∶40（g∶mL）），在80 ℃條件下提取30 min后過濾，將濾渣在85 ℃條件下再次提取30 min，將兩次提取液混合，得到可溶性固形物含量＞2°Bx的玫瑰提取液。

（3）復(fù)合飲料的調(diào)配：飲料用蘋果醋8 mL/100 mL，玫瑰提取液20 mL/100 mL，蔗糖7 g/100 mL，蘋果濃縮汁6 g/100 mL。

（4）過濾、殺菌、灌裝：采用硅藻土過濾，高溫瞬時殺菌（103 ℃，處理2～3 min），瓶裝、封口，即為成品。

1.3.3 樣品處理將蘋果玫瑰復(fù)合醋飲料經(jīng)4 ℃、8 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液保存用于測定。

1.3.4 有機酸含量的測定[5]

采用高效液相色譜法進行標品分析、樣品測定。取10 mL醋液，加入106 g/L亞鐵氰化鉀溶液和300 g/L硫酸鋅溶液各2 mL，搖勻后用超純水定容至100 mL。靜置30 min，移取上清液，用0.45 μm濾膜過濾棄去初濾液，取后續(xù)濾液供HPLC分析用。色譜條件：C18反相色譜柱（250mm×4.6mm，5 μm），流動相：磷酸二氫鈉、甲醇，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為2.8，進樣量10 μL，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，走樣時間為20 min，紫外波長214 nm。

1.3.5 游離氨基酸的測定

參照陳蓉等[10]柱前衍生-高效液相色譜法測定蘋果玫瑰醋中的17種氨基酸含量。以6 mol/L鹽酸150 ℃水解1 h，以異硫氰酸苯酯為柱前衍生化試劑衍生后進樣分析。采用Kromasil C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫43 ℃，流動相A為0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液（以醋酸調(diào)pH 6.5）∶乙腈（93∶7，V/V），流動相B為乙腈∶水（4∶1，V/V），梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm。

1.3.6 基本營養(yǎng)及能量分析

能量的測定按GB/T 28050—2011《食品安全國家標準預(yù)包裝食品營養(yǎng)標簽通則》規(guī)定的方法；鈉的測定按GB/T 5009.91—2017《食品中鉀、鈉的測定》規(guī)定的方法；脂肪的測定按GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》規(guī)定的方法；蛋白質(zhì)的測定按GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》規(guī)定的方法；水分：按GB/T 5009.3—2016《食品中水分的測定》規(guī)定的方法；灰分的測定按GB/T 5009.4—2016《食品中灰分的測定》規(guī)定的方法；膳食纖維的測定按GB/T 5009.88—2014《食品中膳食纖維的測定》規(guī)定的方法。

1.3.7 酚類物質(zhì)測定[3]

標準溶液制備：分別稱取沒食子酸等標準品2.5 mg，配制成4 500 mg/L母液，再配制成在5～100 mg/L范圍內(nèi)的7個不同質(zhì)量濃度梯度的7種單體酚的混合標準溶液，-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品前處理：取30 mL蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料樣品，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，正丁醇等量萃取3次，合并有機相，水相用檸檬酸調(diào)節(jié)pH至2.0，同樣乙酸乙酯萃取3次，合并所有有機相，氮吹，殘渣溶于3 mL色譜甲醇中，測定樣品前經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾。置于-20℃避光保存，待液相分析用。

色譜條件：色譜柱：Kromasil C18反相色譜柱（250 mm×4.6mm，5μm）；流速0.8mL/min；柱溫30℃。檢測波長280nm。梯度洗脫：流動相A，水∶乙酸（98∶2，V/V）；流動相B，乙腈。

1.3.8 抗氧化活性研究

（1）DPPH自由基清除率的測定[11]

配制2×10-4mol/L的DPPH溶液。取樣液2 mL及等體積2×10-4mol/L DPPH溶液加入同一具塞試管中，搖勻，30 min后用無水乙醇作參比測定其在波長517 nm處的吸光度值A(chǔ)i。同時測定2×10-4mol/LDPPH溶液與等體積無水乙醇混合液的吸光度值A(chǔ)c，以及待測液與等體積無水乙醇混合液的吸光度值A(chǔ)j。根據(jù)下列公式計算：

式中：Ac：DPPH與溶劑混合液的吸光度值；Ai：DPPH與樣液反應(yīng)后的吸光度值；Aj：樣液與溶劑混合液的吸光度值。

（2）超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定[12]

采用鄰苯三酚自氧化法。向各試管中加3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，再分別加1 mL的待測液，用pH 8.30的Tris-HCl緩沖液定容至9 mL，測定波長325 nm處的吸光度值，每隔30 s測一次，直到反應(yīng)啟動后的第6分鐘，把所得的數(shù)據(jù)以時間為橫坐標，A325nm值為縱坐標進行線性回歸，得到的直線斜率為反應(yīng)速率ΔA0、ΔA。

式中：ΔA0為鄰苯三酚的自氧化法速率；ΔA為加入樣液后鄰苯三酚自氧化法速率，單位均為吸光度每分鐘的增值。

（3）羥自由基（·OH）清除率的測定[13]

采用水楊酸法。在具塞試管中依次加入2 mmol/L FeSO4溶液2 mL、6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL、取樣液2 mL和1 mmol/L H2O22 mL，搖勻，于37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，在波長510 nm下測定吸光度值A(chǔ)X。并按相同方法，測定不加樣液的溶液的吸光度值A(chǔ)0，不加H2O2的溶液的吸光度值A(chǔ)X0，均以蒸餾水為參比。

式中：A0為空白對照液的吸光度值；AX為加入樣液后的吸光度值；AX0為不加H2O2的樣液本底的吸光度值。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

單因素試驗每組重復(fù)3次，實驗結(jié)果以平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料中有機酸組成分析

按照高效液相色譜分析條件測定，7種有機酸混標分離效果較好，在相同的色譜條件下進樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制出不同有機酸的標準曲線回歸方程見表1。由表1可知，各有機酸標品的標準曲線相關(guān)系數(shù)R2＞0.999 0，線性范圍良好，可用于樣品定量分析。

表1 各種有機酸的回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 Regression equation and correlation coefficient of organic acids

表2 蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料中有機酸含量Table 2 Organic acid content of apple rose vinegar compound beverage

蘋果醋中含有豐富的乙酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸等有機酸，其中乙酸含量占總酸含量的90%以上，是主要的酸味來源，其他酸味起協(xié)調(diào)、柔和酸味的作用。以蘋果醋、玫瑰水提物為主料調(diào)配而成的蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料中乙酸含量為2 742.2 μg/mL，琥珀酸含量為441.5 μg/mL，蘋果酸含量為399.2 μg/mL，檸檬酸含量為246.1 μg/mL，符合國家標準GB/T 30884—2014《蘋果醋飲料》中主要有機酸含量的要求。乙酸的酸味具有刺激性，琥珀酸有鮮味，蘋果酸爽快，檸檬酸酸味圓潤，這些物質(zhì)酸味各異，比例協(xié)調(diào)，共同構(gòu)成了蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料特有的酸味。

2.2 蘋果醋復(fù)合飲料中氨基酸組成與含量

對蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料中的游離氨基酸進行測定，結(jié)果見表3。

表3 蘋果玫瑰醋飲料中游離氨基酸含量Table 3 Contents of free amino acids of apple rose vinegar compound beverage

由表3可知，蘋果玫瑰復(fù)合醋飲料中含有16種游離氨基酸，氨基酸總量為441.47 μg/mL，其中異亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、絲氨酸的含量較高，分別達到233.10 μg/mL、68.06 μg/mL、47.84 μg/mL、30.49 μg/mL。異亮氨酸與亮氨酸和纈氨酸一起合作有修復(fù)肌肉、控制血糖作用。氨基酸是維系人體生命活動的重要物質(zhì)，它不僅具有各種生理功能，而且對果醋的酸味具有緩沖作用，使其更加柔和、鮮美、醇厚[14-15]，并給身體組織提供能量的作用，絲氨酸是腦等組織中絲氨磷酸脂的組成部分，有降低血液中的膽固醇濃度、防治高血壓的作用[16-18]。由此可見，蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料中氨基酸種類豐富，含量較高，具有一定營養(yǎng)價值。

蘋果玫瑰復(fù)合醋飲料中共含有7種必需氨基酸，必需氨基酸總量為273.35μg/mL，占總氨基酸含量的61.92%，其中異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸含量較高，分別為233.10 μg/mL、21.79μg/mL和12.21μg/mL；含有呈味氨基酸總量為64.83μg/mL，占總氨基酸含量的14.69%。其中天冬氨酸與味覺中的酸味形成有關(guān)，甘氨酸、丙氨酸與甜味有關(guān)，谷氨酸與鮮味物質(zhì)形成有關(guān)，蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料中天冬氨酸含量為47.84 μg/mL，谷氨酸含量為6.57 μg/mL，丙氨酸含量為4.6 μg/mL，甘氨酸含量為1.29 μg/mL，這些氨基酸在提高蘋果玫瑰復(fù)合醋飲料營養(yǎng)品質(zhì)的基礎(chǔ)上，進一步豐富了果醋飲料的口感和滋味。

2.3 蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料中的營養(yǎng)成分

蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料中蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物、鈉等基本營養(yǎng)成分及能量的測定結(jié)果見表4。

表4 蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料營養(yǎng)及能量測定結(jié)果結(jié)果Table 4 Determination results of nutritional components and energy of apple rose vinegar compound beverage

蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物和鈉在我國是最具有公共衛(wèi)生意義的營養(yǎng)素。缺乏可以引起營養(yǎng)不良、影響兒童和青少年生長發(fā)育和健康，過量導(dǎo)致肥胖和慢性病發(fā)生發(fā)展。由表4可知，蘋果玫瑰醋飲料中能量82 kJ/100 mL，碳水化合物含量為4.5 g/100 mL，鈉含量為18 mg/100 mL，蛋白質(zhì)、脂肪含量甚微以0計。與市場上其他飲料比較，碳水化合物含量、能量較低，適宜日常飲用。

2.4 蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料抗氧化性測定

2.4.1 蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料中酚類物質(zhì)含量

對蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料中單體酚類物質(zhì)含量進行測定，結(jié)果見表5。由表5可知，7種單體酚總含量為266.97 μg/mL，其中沒食子酸和香草酸含量較高，分別為162.42 μg/mL、97.09 μg/mL。酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗自由基等生物活性及抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用，謝曉燕等[19-20]研究表明，沒食子酸在質(zhì)量濃度5～50 μg/mL范圍內(nèi)對DPPH自由基有明顯的清除能力，在質(zhì)量濃度50～400 μg/mL范圍內(nèi)對羥自由基有明顯的清除能力。李曉嬌等[3]研究表明，蘋果醋中沒食子酸、香草酸、阿魏酸等含量相對較低，結(jié)果表明，蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料中酚酸含量相對較高，具有較強的抗氧化性。進一步說明蘋果醋中添加玫瑰提取液復(fù)配工藝配方提高了果醋飲料中酚類物質(zhì)含量，改變了果醋飲料的營養(yǎng)成分，提高了抗氧化能力。

表5 蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料中酚類物質(zhì)含量Table 5 Contents of phenolic substances in apple rose vinegar compound beverage

2.4.2 蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料抗氧化性結(jié)果

以蘋果醋單一飲料為對照，進行不同玫瑰提取液含量（0～500 μL/mL）的復(fù)合果醋清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基實驗，結(jié)果如圖1所示。

圖1 蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料對DPPH自由基（A）、超氧陰離子自由基（B）和羥自由基（C）清除率Fig.1 DPPH free radical (A),superoxide anion radical (B) and hydroxyl radical (C) scavenging rate of apple rose vinegar compound beverage

由圖1可知，蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料和蘋果醋單一飲料（玫瑰提取液濃度為0）對3種自由基均有一定清除能力，隨著復(fù)合果醋中玫瑰提取液添加濃度的增加，自由基清除能力顯著提高，當(dāng)果醋飲料中玫瑰提取液濃度增加至500μL/mL時，蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料DPPH自由基清除率為93.82%，羥自由基清除率為76.58%，超氧自由基清除率為54.61%，且復(fù)合飲料的抗氧化性能顯著高于單一飲料（P＜0.05）。抗氧化能力是各類具抗氧化性保健因子的綜合效應(yīng)，在單一蘋果醋飲料中添加一定量的玫瑰提取液對果醋飲料的抗氧化能力起著顯著的影響，但玫瑰提取液添加量過高會造成飲料渾濁和澀味加重，故在復(fù)合飲料的調(diào)配中需綜合考慮。

3 結(jié)論

對自制的蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料進行營養(yǎng)成分及抗氧化活性分析，結(jié)果顯示：蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料中有機酸含量豐富，其中乙酸含量為2 742.2 μg/mL，琥珀酸含量為441.5 μg/mL，蘋果酸含量為399.2 μg/mL，檸檬酸含量為246.1 μg/mL，它們相互協(xié)調(diào)組成產(chǎn)品特有的酸味。蘋果玫瑰醋復(fù)合飲料中含有16種氨基酸，總量達到441.47 μg/mL，必需氨基酸7種，總量為273.35 μg/mL，占總氨基酸含量的61.92%；呈味氨基酸5種，含量為64.83 μg/mL，占總氨基酸含量的14.69%。對飲料中的基本營養(yǎng)素進行測定，結(jié)果顯示能量為82 kJ/100 mL，碳水化合物含量為4.5 g/100 mL，不含蛋白和脂肪。對果醋飲料中的抗氧化活性成分及抗氧化能力進行研究，結(jié)果顯示復(fù)合果醋飲料中沒食子酸含量達到162.42 μg/mL。當(dāng)復(fù)合果醋中玫瑰提取液體積分數(shù)為500 μL/mL時，其DPPH自由基清除率為93.82%，羥自由基清除率為76.58%，超氧陰離子自由基清除率為54.61%，與單一蘋果醋飲料相比，復(fù)合果醋飲料抗氧化性能明顯提高。