烏魯木齊地區(qū)RT-PCR法檢測兒童急性呼吸道病毒的臨床研究

伊合帕爾·吐依洪 比拉里·艾山 姜敏 張洪平 王晶

新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院呼吸科 新疆呼吸病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊830000

急性呼吸道感染(acute respiratory tract infections,ARTIs)是一個持續(xù)而普遍的公共衛(wèi)生問題。在全世界范圍內(nèi)有分布范圍廣,致死率高的特點(diǎn),對嬰幼兒、老年人以及免疫功能低下人群造成極大威脅[1]。ARTIs可由細(xì)菌、病毒和支原體感染引起,而病毒感染是導(dǎo)致ARTIs的非常重要的一種病因[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),大約90%的病例為呼吸道病毒感染所導(dǎo)致的。ARTIs發(fā)病是由許多因素單獨(dú)或共同決定的,這些因素包括年齡、性別、營養(yǎng)狀況、母乳喂養(yǎng)(類型和持續(xù)時間)、社會經(jīng)濟(jì)狀況和人口分布等[3]。常見的引起呼吸道感染的病毒種類主要包括呼吸道合胞病毒,副流感病毒,流感病毒,腸病毒,腺病毒,人鼻病毒,人后肺病毒,人冠狀病毒229E、OC43、NL63、HKU1和SARS[4-8]。近年來,新疆地區(qū)干旱少雨,不同季節(jié)氣候變化明顯,晝夜溫差較大是呼吸道疾病高發(fā)的主要原因。隨著疾病治療過程中抗生素的廣泛應(yīng)用,呼吸道病毒感染較細(xì)菌感染呈上升趨勢,而探索一種高效、快速檢測呼吸道病毒的方法對呼吸道病毒感染診斷和合理用藥具有重大的作用。傳統(tǒng)的呼吸道病毒的檢測方法包括病毒的分離培養(yǎng)、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)以及一些國外開發(fā)出的呼吸道病毒快速診斷試劑盒等[9]。然而這些傳統(tǒng)的方法耗時較長,過程繁瑣,耗費(fèi)較多的人力物力,且檢測效率較低,敏感度和特異度都不高[10-11]。隨著PCR技術(shù)的興起,分子生物學(xué)方法檢測呼吸道病毒應(yīng)用逐漸廣泛。本文通過多重?zé)晒釸T-PCR檢測了新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院2015年1月至2017年12月住院呼吸道分泌物中的人腺病毒(human adenovirus,HADV)、 人 偏 肺 病 毒(human metapneumo virus,HMPV)、人博卡病毒(human bocavirus,HBo V)、人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)4種呼吸道病毒。分析這4種病毒在本地區(qū)門診發(fā)熱兒童患者中感染情況及與年齡、季節(jié)的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2015年1月至2017年12月新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院住院患者1 045例。其中男574例,女471例;年齡(4.9±2.7)歲,年齡范圍為1～12歲。按文獻(xiàn)[3]診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為呼吸道感染。

1.2 臨床樣本核酸模板的制備 臨床樣本取自以上1 045例呼吸道疾病患者的咽拭子和含嗽液,加入PBS緩沖液放在4℃冰箱浸泡過夜。提取HADV、HBo V、HMPV、HRSV 4種呼吸道病毒核酸,以引起相似臨床癥狀的其他類型呼吸道病毒(如流感病毒、冠狀病毒等)的臨床樣本作為對照。

1.3 引物與探針設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)[12],選取HADV、HBo V、HMPV和HRSV 4種病毒基因的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,使用Premier 6.0設(shè)計(jì)特異性引物和Taq Man探針,同時使用Oligo 7軟件和NCBI上的BLAST評價(jià)引物及探針特異性分析(表1)。引物和探針均由上海生工合成,引物為PAGE級純化,探針為HPLC級純化。

1.4 多重?zé)晒饽孓D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)反應(yīng)體系 采用北京全式金公司的Transcript Green One Step RT-PCR試劑盒,根據(jù)說明書在反應(yīng)體系中同時加入4種呼吸道病毒的特異性引物、Taq Man探 針。反 應(yīng) 體 系 包 括:2×TransStart one-step Reaction Mix 12.5μl,TransStart one-step Enzyme 0.4μl,Primer Script RT Enzyme MixⅡ0.5μl,最后加去離子水補(bǔ)充至25μl,HADV、HBo V、HMPV、HRSV 4種呼吸道病毒的4對上下游特異性引物和探針(濃度分別為40μmol/L和20μmol/L)各0.4μl。陽性孔加入4種呼吸道病毒其中的1種病毒的體外轉(zhuǎn)錄RNA 5μl,陰性內(nèi)參加入去離子水5μl。熒光RT-PCR反應(yīng)條件為:45℃,15～30 min;95℃,10 s;95℃,5 s;60℃,1 min 40個 循 環(huán),在60℃,1 min階段收集熒光。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)資料用率(%)表示,采用Studentt和χ2檢驗(yàn)進(jìn)行。組間比較和離散變量的關(guān)聯(lián)性分析采用χ2檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 用于4種病毒的熒光RT-PCR的引物及探針

2 結(jié)果

2.1 1 045例患兒中4種病毒感染陽性率 1 045例患兒中,呼吸道病毒檢測有281例結(jié)果為陽性,總陽性率為26.89%。其中,男性患兒中有121例陽性,占比43.06%;女性患兒中有160例陽性,占比56.94%。男女病毒感染比例為0.76∶1。兩者陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.172,P=0.547)。281例陽性患兒中單種病毒感染194例,2種及以上病毒混合感染87例,單科病毒混合病毒感染比例為2.23∶1。

2.2 呼吸道4種病毒感染的構(gòu)成 281例病毒感染患兒中HMPV感染最多,為120例(42.70%)、其次為HRSV感染119例(42.35%)。4種病毒多重?zé)晒釸T-PCR特異性檢驗(yàn)結(jié)果顯示:在194例單種病毒感染患兒HMPV感染率最高,為85例(43.81%),其次為HRSV,為56例(28.87%)。在87例混合病毒感染患兒中HRSV感染率最高,為63例(72.41%),其次為HADV,為58例(66.67%),見表2、3。

2.3 呼吸道4種病毒感染與年齡的關(guān)系 表4為4種呼吸道病毒感染和年齡的關(guān)系。結(jié)果可知≤3歲組陽性229例(36.06%),4～7歲組陽性114例(42.22%),≥8歲組陽性63例(45.00%)?！?歲組陽性率高于4～7歲組,顯著高于≤3歲組(P＜0.05);而4～7歲組和≥8歲組則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)?！?歲組HMPV陽性例數(shù)最多,為80例(12.60%),4～7歲組HRSV陽性比例最大,為38例(14.07%)。≥8歲組則以HADV感染比例最大,為26例(18.57%)。見表4。

表2 4種病毒多重?zé)晒釸T-PCR體系特異性檢驗(yàn)

表3 4種呼吸道病毒組成[例(%)]

2.4 呼吸道病毒感染與季節(jié)的關(guān)系 由表5可以看出春、夏、秋、冬四季的陽性率分別為25.68%、28.24%、49.34%、65.57%。冬季4種病毒感染陽性率均高于其他3個季節(jié)(P＜0.05)。春季病毒感染以HADV和HMPV感染最多;夏季和秋季同樣以HMPV病毒感染最多,冬季則以HRSV多發(fā)。見表5。

表4 各年齡組4種呼吸道病毒的構(gòu)成[例(%)]

3 討論

呼吸道感染是導(dǎo)致小兒發(fā)病和死亡的一個重要原因,降低其發(fā)病率及病死率,明確病原是首要問題[13]。病毒感染在呼吸道感染中占有非常大的比例。目前認(rèn)為常見的呼吸道病毒有7種,本文選取4種研究較成熟的病毒作為研究對象,結(jié)合新疆季節(jié)變化,地域差別以及不同發(fā)病年齡,分析4種病毒的流行趨勢。目前,大多數(shù)呼吸道疾病病毒感染檢測基于病毒分離培養(yǎng),但耗時耗力,同時假陰性結(jié)果較多,不能及時指導(dǎo)臨床治療[14]。近年來基于核酸的多重?zé)晒舛縍T-PCR法靈敏度和特異度均取得一定成果[15]。本研究1 045例患兒為烏魯木齊地區(qū)2015年1月至2017年12月住院的呼吸道疾病兒童,其中檢測出281例陽性,總檢出率為26.89%。其中男、女檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),說明4種呼吸道病毒感染性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

比較以往的研究,廣州、重慶等地小兒呼吸道病毒感染以HRSV為主[16-17]。而本研究發(fā)現(xiàn)281例病毒感染陽性患兒中HMPV檢出率最高(42.70%),其次為HRSV(42.35%)。因此HMPV可能是2015年1月至2017年12月烏魯木齊地區(qū)呼吸道感染首要的病毒病原;同時HRSV也有較高的感染率,僅與HMPV感染相差1例。其次為HADV(35.23%)和HBo V(24.20%)。此外本研究發(fā)現(xiàn)2種及以上病毒混合感染率達(dá)30.96%(87/281),明顯高于以往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果[18]?？梢?不同病毒的混合感染在小兒呼吸道病毒感染中占有相當(dāng)一部分的比例。而在87例混合病毒感染中,與HRSV相關(guān)的感染最多,表明HRSV易發(fā)生混合感染。

從不同年齡組來看,≥8歲組病毒檢出率最高,高于4～7歲組,且顯著高于≤3歲組(P＜0.05),該結(jié)果與文獻(xiàn)[19]報(bào)道結(jié)果不一致,可能是與該階段入院的≤3歲組患兒基數(shù)較大相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),HMPV在≤3歲組中檢出率最高(12.60%);隨著年齡增大,4～7歲組及≥8歲組檢出率依次降低。由于嬰幼兒期機(jī)體免疫低下,體液免疫功能尚未完善,HMPV與喘息性疾病的發(fā)生有一定關(guān)系;同時HMPV易合并其他病毒感染,故HMPV是嬰幼兒期呼吸道感染的防治重點(diǎn)[20]。

呼吸道病毒流行的影響很多,但季節(jié)的變化是其主要的原因。本研究患兒呼吸道疾病高發(fā)主要為春季,其次為冬季。這可能是由于烏魯木齊地區(qū)冬春交替氣溫變化較大所致。從病毒感染的結(jié)果來看盡管春季患兒較多,但僅較少部分為病毒感染。可能與春季花粉、粉塵等各種過敏原較多有關(guān)。因此采用快速準(zhǔn)確的病毒檢驗(yàn)方法可以避免因過敏引起的呼吸道癥狀而導(dǎo)致誤診。整體趨勢來看,隨著季節(jié)的變化病毒感染比例有逐漸上升的趨勢,這與張雪清等[4]研究相同。冬季呼吸道疾病發(fā)生在4個季節(jié)中僅次于春季,同時是病毒感染的高發(fā)季節(jié),高達(dá)65.57%。究其原因可能是烏魯木齊地區(qū)近年來冬季寒冷,氣溫變化反復(fù),病毒易滋生。不同季節(jié)來看,春、夏、秋三季的病毒感染主要病原體分別為HADV、HMPV和HMPV,而冬季以HRSV為主。Feikin等[21]應(yīng)用RT-PCR的方法檢測因呼吸道感染住院的患兒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HRSV檢出率為79.10%,且有86例為混合感染。Cilla等[22]利用PCR和間接免疫熒光方法檢測338例1～35個月患兒,HRSV檢出率為55.70%;HBoV檢出率為54.10%,混合感染61例。以上研究病毒檢出率均高于我們的研究,同時幼兒中混合感染的比例均較高。

綜上所述,HMPV是本地區(qū)小兒呼吸道病毒感染的首要病原,在3歲以下嬰幼兒中感染率最高;其次為HRSV,在4～7歲兒童中感染率最高。從季節(jié)上來看,嬰幼兒病毒感染主要發(fā)生冬季,且同季節(jié)病毒感染的發(fā)病率及病原構(gòu)成差異較大。多重?zé)晒舛縍T-PCR法是一種快速而準(zhǔn)確的檢測呼吸道病毒的方法,及時的檢出病毒對后期疾病及時對癥治療,縮短病程,為臨床診斷和治療提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

表5 各季節(jié)4種呼吸道病毒的構(gòu)成[例(%)]

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突