鄒威鳳 王曉茜 盛青 周曉婷 黎希

廣州市胸科醫(yī)院呼吸科510000

COPD主要的病理改變包括氣道慢性炎癥和氣道重塑,其中,小氣道重塑是引起COPD患者持續(xù)存在的氣流受限的主要原因。既往研究表明高遷移率族蛋白1(high mobility group protein B1,HMGB1)/晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)信號通路參與了COPD氣道炎癥和重塑,且與氣道阻塞程度呈正相關(guān)[1-2]。HMGB1/RAGE信號通路可通過調(diào)節(jié)促纖維因子轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,FGF-2)的分泌從而參與肺纖維化形成[3]。吸煙作為影響COPD發(fā)生、發(fā)展的重要危險因素,研究表明香煙煙霧可誘導大鼠肺和氣道HMGB1/RAGE的表達[4-5],體外研究顯示香煙煙霧提取物可促進肺上皮細胞A549和R3/1細胞株中RAGE及其配體的表達[6]。我們前期研究已證實香煙煙霧主要成分之一尼古丁可誘導氣道上皮細胞中HMGB1[7]的分泌。本研究旨在探討尼古丁是否通過HMGB1/RAGE信號通路調(diào)控氣道上皮細胞TGF-β1和FGF-2的分泌。

1 材料與方法

1.1 材料 人氣道上皮細胞株16HBE(廣州醫(yī)科大學提供),DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司),尼古丁(美國SanDiego公司),HMGB1 siRNA、RAGE抗體、RAGE中和抗體、IgG抗體(美國R&D公司),HMGB1、TGF-β1和FGF-2酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(美國R&D公司)。

1.2 正常人支氣管上皮細胞株HBE培養(yǎng)及處理 10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液,按2×10-5細胞/瓶將細胞接種于6孔板中,使細胞生長再次達到60%～70%融合?？瞻讓φ战M換為無血清DMEM培養(yǎng)基,尼古丁(6×10-6mol/L)刺激細胞24 h后收集細胞。其中HMGB1 siRNA處理組分組:空白對照組、尼古丁組、陰性對照siRNA+尼 古 丁 組、HMGB1 siRNA+尼 古 丁 組、HMGB1 siRNA+空白對照組;RAGE中和抗體處理組分組:空白對照組、尼古丁組、IgG+尼古丁組、RAGE中和抗體+尼古丁組(每組設(shè)3個復孔)。

根據(jù)實驗時間取出培養(yǎng)板,各孔的培養(yǎng)上清液離心,取上清液于小離心管中-70℃保存,備用。

1.3 HMGB1 siRNA轉(zhuǎn)染 細胞干預前24 h將細胞接種于6孔培養(yǎng)板,使得次日進行干預時細胞融合達60%。將脂質(zhì)體與HMGB1 siRNA和陰性對照siRNA均按6μl∶6μl分別加入100 ml DMEM培養(yǎng)基,二者混合后室溫下放置20 min。分別加入干擾組、陰性對照組,常規(guī)體外培養(yǎng)5 h。再加入1 ml DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)19 h。

1.4 RAGE中和抗體轉(zhuǎn)染 細胞干預前24 h將細胞接種于6孔培養(yǎng)板,2 ml含F(xiàn)BS的無抗生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基,接種密度為2×10-5/孔,使得次日進行干預時細胞融合達60%。將RAGE中和抗體和陰性對照IgG抗體分別加入干擾組、陰性對照組,預先培養(yǎng)1 h。再繼續(xù)加入尼古丁刺激培養(yǎng)24 h。

1.5 ELISA檢測 ELISA檢測人支氣管上皮細胞HMGB1、TGF-β1和FGF-2的分泌采用ELISA試劑盒測定培養(yǎng)液HMGB1、TGF-β1和FGF-2含量,檢測方法按試劑盒說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學分析 用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)以表示,兩個樣本均數(shù)的比較采用t檢驗;多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組中HMGB1蛋白分泌的比較ELISA檢測顯示,尼古丁刺激24 h后HMGB1蛋白的分泌量較未給予尼古丁刺激的正常對照組明顯增加,經(jīng)HMGB1 siRNA預處理后再給予尼古丁干預24 h,HMGB1蛋白在干擾組的分泌量比單純的尼古丁干預組明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而給予陰性對照siRNA預處理后再給予尼古丁干預,HMGB1蛋白分泌量與單純尼古丁干預組比較,差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。

圖1 ELISA顯示經(jīng)HMGB1 siRNA預處理后HMGB1蛋白在干擾組的分泌量比單純的尼古丁組明顯減少

2.2 不同處理組中RAGE蛋白表達的比較Western blotting檢測顯示,尼古丁刺激24 h后RAGE蛋白的表達量較未給予尼古丁刺激的正常對照組明顯增加,經(jīng)HMGB1 siRNA預處理后再給予尼古丁干預24 h,RAGE蛋白在干擾組的表達量比單純的尼古丁干預組明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而給予陰性對照siRNA預處理后再給予尼古丁干預,RAGE蛋白表達量與單純尼古丁干預組比較,差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。

Western blotting檢測顯示,經(jīng)RAGE中和抗體預處理后再給予尼古丁干預,RAGE蛋白在干擾組的分泌量比單純的尼古丁干預組明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);給予陰性對照IgG預處理后再給予尼古丁干預24 h,RAGE的蛋白分泌與單純尼古丁干預組比較,差異無統(tǒng)計學意義(圖3)。

2.3 不同處理組中TGF-β1和FGF-2蛋白分泌的比較結(jié)果 見圖4。ELISA檢測顯示,尼古丁刺激24 h后TGF-β1和FGF-2蛋白的分泌量較未予尼古丁刺激的空白對照組明顯增加,經(jīng)HMGB1 siRNA或RAGE中和抗體預處理后再給予尼古丁干預24 h,TGF-β1和FGF-2蛋白在干擾組的分泌量比單純的尼古丁干預組明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而給予陰性對照siRNA或IgG預處理后再給予尼古丁干預,TGF-β1和FGF-2蛋白分泌量與單純尼古丁干預組比較,差異無統(tǒng)計學意義(圖4)。

圖2 Western blotting顯示經(jīng)HMGB1 siRNA預處理后RAGE蛋白表達的比較

3 討論

吸煙是公認的導致COPD發(fā)病和不可逆氣流受限進展的最為重要的致病因素,其中主要成分之一尼古丁可能會通過上調(diào)促纖維化因子而參與COPD中的氣道重塑,氣道重塑是COPD發(fā)生、發(fā)展最主要的機制之一。我們在研究中發(fā)現(xiàn)尼古丁可誘導HMGB1和TGF-β1的分泌。研究報道損傷的上皮細胞可分泌各種促纖維化因子,其中包括TGF-β1[8]和FGF-2[9]。HMGB1/RAGE信 號 通 路可進一步通過調(diào)節(jié)促纖維因子TGF-β1和FGF-2的分泌從而參與氣道重塑形成[10]。

HMGB1是廣泛存在于真核細胞核中重要的非組蛋白之一,具有多種核外的生物學功能,與誘導炎癥反應(yīng)、細胞分化、細胞遷移等密切相關(guān)。并在多種組織和細胞中廣泛分布。病理狀態(tài)下,細胞破壞可引起HMGB1釋放到細胞間隙并結(jié)合相應(yīng)的受體如RAGE、Toll樣受體2(toll-like receptor 2,TLR-2)、TLR-4,從而合成并釋放細胞因子[11]。其中RAGE屬于免疫球蛋白的一種,是一種跨膜信號轉(zhuǎn)導受體。釋放到細胞間隙的HMGB1可上調(diào)RAGE的表達。RAGE高水平表達于正常肺組織,尤其是肺內(nèi)皮細胞、支氣管上皮細胞、肺泡巨噬細胞和Ⅰ型肺泡上皮細胞。體外研究顯示香煙煙霧提取物可促進肺上皮細胞A549和R3/1細胞株中RAGE及其配體的表達。

圖3 Western blotting顯示經(jīng)RAGE中和抗體預處理后RAGE蛋白表達的比較

我們前期研究已證實香煙煙霧主要成分之一尼古丁可誘導氣道上皮細胞中HMGB1的分泌。結(jié)合我們前期實驗結(jié)果,我們推測尼古丁可能通過HMGB1/RAGE信號通路調(diào)控氣道上皮細胞TGF-β1和FGF-2分泌,從而參與了吸煙所致的COPD氣道重塑。為此我們觀察了HMGB1/RAGE信號通路在尼古丁調(diào)控16HBE細胞TGF-β1和FGF-2分泌中的作用,結(jié)果顯示尼古丁可誘導16HBE細胞HMGB1、TGF-β1和FGF-2的分泌和RAGE表達。既往研究報道HMGB1可主要通過RAGE配體誘導支氣管上皮細胞中各種細胞因子的分泌[11-12]。因此我們在各實驗組加入HMGB1 siRNA后,檢 測RAGE的 表 達 量 及TGF-β1和FGF-2的分泌量。實驗表明經(jīng)HMGB1 siRNA干預后,HMGB1的分泌量較單純尼古丁刺激組明顯減少,RAGE的表達量顯著減少。同時TGF-β1和FGF-2的分泌量較單純尼古丁刺激組顯著減少。這說明HMGB1/RAGE可能在尼古丁誘導支氣管上皮細胞TGF-β1和FGF-2的分泌中起重要作用。

圖4 ELISA顯示TGF-β1和FGF-2蛋白在干擾組的分泌量比尼古丁組明顯減少 A:HMGB1siRNA干擾后TGF-β1和FGF-2蛋白表達量;B:RAGE中和抗體干擾后TGF-β1和FGF-2蛋白表達量

也有研究報道HMGB1可通過配體TLR-2和TLR-4誘導巨噬細胞中各種細胞因子的分泌[13]?；诖?我們在各實驗組進一步加入RAGE中和抗體預處理后,檢測TGF-β1和FGF-2的分泌量。實驗表明經(jīng)RAGE中和抗體預處理后,TGF-β1和FGF-2的分泌量較單純尼古丁刺激組顯著減少。通過分析我們的實驗結(jié)果與既往的文獻,提示HMGB1可能通過促進RAGE的表達參與了尼古丁調(diào)控人支氣管上皮細胞TGF-β1和FGF-2的分泌,從而促進了吸煙所致COPD患者氣道的重塑。該研究為尋找更有針對性的治療吸煙相關(guān)的COPD的新靶點提供了理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突