曹丹，彭浩，2，*，蘭阿峰，2，解修超，2，鄧百萬(wàn)，2，趙航軻，2

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723000；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西漢中723000）

淀粉酶能夠水解淀粉生成葡萄糖、麥芽糖以及其它低聚糖，按結(jié)構(gòu)的不同可以分為α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶以及異淀粉酶4 種[1]。其中，α-淀粉酶（液化酶）能夠分解直鏈淀粉和支鏈淀粉分子內(nèi)部的α-1，4糖苷鍵而產(chǎn)生葡萄糖和少量麥芽糖及麥芽三糖[2]。α-淀粉酶存在于自然界各種動(dòng)植物以及微生物中，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、紡織業(yè)、畜牧業(yè)以及環(huán)保領(lǐng)域[3]。

α-淀粉酶是我國(guó)工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)量最高的酶制劑產(chǎn)品，產(chǎn)量約占我國(guó)整個(gè)酶制劑產(chǎn)品產(chǎn)能的一半以上[4]。近年來(lái)，雖然我國(guó)投產(chǎn)的淀粉酶品種和產(chǎn)能在不斷增加，但在菌種及生產(chǎn)工藝上與國(guó)外相比尚有一定差距[5]。由于進(jìn)行產(chǎn)酶基因工程菌株構(gòu)建存在成本高，難度大等問(wèn)題。因而，目前產(chǎn)酶菌株仍然以分離野生菌株后馴化為主，需要不斷從自然界中分篩選性能優(yōu)異的菌株，為淀粉酶的工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)新的活力[6-7]。

隨著制酶工業(yè)的發(fā)展，對(duì)高產(chǎn)淀粉酶產(chǎn)生菌的選育已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。土壤蘊(yùn)含著大量的微生物資源，尤其富含產(chǎn)生各種酶類的細(xì)菌[8-9]。本文從富含淀粉酶產(chǎn)生菌的不同土壤環(huán)境中分離篩選高產(chǎn)淀粉酶菌株，并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行初步研究，以期為相關(guān)工業(yè)生產(chǎn)奠定理論及應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)所用樣品采集時(shí)間為2018 年3 月，采集地點(diǎn)為陜西省漢中市勉縣天元面粉廠廠區(qū)、陜西理工大學(xué)食堂廚余垃圾傾倒處和陜西省漢中市康田農(nóng)業(yè)園區(qū)菜園土壤樣品，采集深度為5 cm～15 cm 共計(jì)9 份土壤樣品于4 ℃保存。

1.2 培養(yǎng)基

1）初篩培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 3.0 g，NaCl 5.0 g，可溶性淀粉2.0 g，瓊脂粉20.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 值自然，121 ℃，滅菌 20 min[10]；

2）種子培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 3.0 g，NaCl 5.0 g，加蒸餾水至 1 000 mL，pH 值自然，121 ℃，滅菌20 min[11]；

3）發(fā)酵培養(yǎng)基：無(wú)水氯化鈣 8.0 g，可溶性淀粉10.0 g，磷酸氫二鈉8.0 g，硫酸銨 8.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH 值：7.0～7.2，121 ℃，滅菌 20 min[12]；

1.3 菌株的分離和篩選

1）平板初篩：在無(wú)菌條件下，將采集的土壤樣品稱取25 g 加入到225 mL 裝有若干玻璃珠的無(wú)菌水中制備菌懸液，80 ℃水浴鍋中保持20 min，去除不耐熱的非芽孢桿菌，水浴后靜置5 min[13]。依次做10 倍梯度稀釋液至 10-6，分別移取 10-4、10-5和 10-6的稀釋液各200 μL，涂布于初篩培養(yǎng)基上，（36±1）℃培養(yǎng) 24 h～48 h 后，觀察菌落生長(zhǎng)情況，并滴加0.05%碘液測(cè)定菌落周?chē)该魅χ睆剑℉）以及菌落直徑（C），計(jì)算其比值[14]。

2）搖瓶復(fù)篩：將初篩獲得的菌株接種于100 mL 種子培養(yǎng)基中，（36±1）℃，130 r/min 振蕩培養(yǎng) 48 h 后，以5%接種量將上述種子液接種于100 mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，相同的條件培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液以5 000 r/min離心10 min 取上清，測(cè)定其酶活力[15]。

1.4 酶活力測(cè)定

1.4.1 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以麥芽糖為參照物質(zhì)，按3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。

1.4.2 淀粉酶酶活力測(cè)定

取1 mL 稀釋后的酶液于試管中，加入1 mL 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制含1%可溶性淀粉的底物溶液，40 ℃ 保溫 10 min，加入 2 mL DNS 試劑，煮沸顯色10 min，于540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力單位[17]。[酶活力單位定義：在40 ℃，pH 6.0 條件下，每分鐘從1 mL 1 %的可溶性淀粉溶液中釋放出1 mmol 麥芽糖的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U/mL）[18]]。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

通過(guò)平板培養(yǎng)觀察其菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色觀察其特征[19]；參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行相關(guān)生理生化試驗(yàn)。

1.5.2 16S rDNA 序列分析

將提取的菌株總DNA 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用16S rDNA 通用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增[21]。引物由上海生工生物工程有限公司提供，其正向引物（27F）：5＇-AGTTTGATCCTGGTCAG-3＇；反向引物（1492R）：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT - 3＇；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃～65 ℃，30 s；72 ℃，2 min；共計(jì)30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 10min，擴(kuò)增引物 4 ℃保存[22-24]。將產(chǎn)物送交上海生工生物工程有限公司測(cè)序，將測(cè)得序列提交NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast 同源比對(duì)，使用MEGA5.0 軟件分析，Neighbor-Joining 法構(gòu)建菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，確定菌株的分類地位[25]。

1.6 菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.6.1 最佳產(chǎn)酶條件單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇6 種碳源（可溶性淀粉、糊精、玉米淀粉、麩皮、蔗糖和葡萄糖），6 種氮源（蛋白胨、硝酸銨、牛肉粉、酵母膏、牛肉粉+蛋白胨和酵母膏+蛋白胨），6 種無(wú)機(jī)鹽（硫酸錳、硝酸鉀、硫酸鎂、硝酸鈉、無(wú)水氯化鈣和硫酸亞鐵），分別等量代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，配制不同發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)定發(fā)酵液酶活力，根據(jù)酶活力大小篩選出最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽。

1.6.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選出的培養(yǎng)基成分，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1，確定最佳培養(yǎng)基配方。

表1 產(chǎn)淀粉酶菌株培養(yǎng)基組分優(yōu)化的正交試驗(yàn)方案Table 1 Orthogonal test protocol for optimization of medium components for amylase producing strains

1.6.3 培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以優(yōu)化后的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別分析不同初始 pH 值（5.5、6.0、6.5、7.0 和 7.5）、培養(yǎng)時(shí)間（24、48、72、96 h 和 120 h）、轉(zhuǎn)速（100 、110、120、130 r/min 和 140 r/min）和培養(yǎng)溫度（28、31、34、37 ℃和40 ℃）對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離和初篩

將1.3 中的土壤稀釋液涂布于初篩平板培養(yǎng)后，根據(jù)菌落形態(tài)和顯微形態(tài)的差異，共獲得產(chǎn)淀粉酶菌株173 株。分別測(cè)定菌株直徑1 mm 時(shí)透明圈直徑（H）與菌落的直徑（C）比值，即H/C 值，篩選出1 株淀粉酶產(chǎn)生能力較強(qiáng)的菌株，編號(hào)MF04，具體見(jiàn)圖1。其H/C值為4.37，酶活力值為32.5 U/mL。

圖1 菌株MF04Fig.1 Strain MF04

2.2 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化試驗(yàn)結(jié)果

革蘭氏染色和芽孢染色形態(tài)如圖2、圖3 所示。

圖2 革蘭氏染色形態(tài)Fig.2 Gram staining morphology

圖3 芽孢染色形態(tài)Fig.3 Spore staining morphology

通過(guò)平板培養(yǎng)后觀察菌株MF04 菌落呈現(xiàn)乳白色，不透明，菌落大，表面粗糙，有褶皺，不規(guī)則，挑起呈絲狀。菌體大小約（1.0～1.2）×（3.0～5.0）μm，長(zhǎng)桿狀。經(jīng)革蘭氏染色和芽孢染色，鑒定其為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，芽孢可見(jiàn)，長(zhǎng)約1.5 μm，呈橢圓形。對(duì)菌株MF04 進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，菌株MF04 與枯草芽孢桿菌，蠟狀芽孢桿菌的生理生化特征類似，結(jié)果如表2 所示。

表2 生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical test identification results

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

菌株MF04 經(jīng)16S rDNA 通用引物PCR 擴(kuò)增后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 菌株MF04 16S rDNA 電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Results of strain MF04 16S rDNA electrophoresis

結(jié)果表明，菌株MF04 與蠟狀芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌等的16S rDNA 都具有高度相似性，同源性均為99 %，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖5 所示，分析其與Bacillus cereus strain 親緣關(guān)系最近。

2.4 產(chǎn)酶條件研究

2.4.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)菌株MF04 產(chǎn)酶活力的影響見(jiàn)圖6、圖7 和圖8。

培養(yǎng)基中不同碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響較大，當(dāng)碳源為2%糊精，氮源為0.5%蛋白胨，無(wú)機(jī)鹽為0.4%硫酸錳時(shí)，菌株MF04 的產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，酶活力最高，為48.2 U/mL。

圖5 菌株MF04 16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Strain MF04 16S rDNA sequence phylogenetic tree

圖6 不同碳源對(duì)菌株MF04 產(chǎn)酶活力的影響Fig.6 Effect of different carbon sources on enzyme activity of strain MF04

圖7 不同氮源對(duì)菌株MF04 產(chǎn)酶活力的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on enzyme activity of strain MF04

圖8 無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)菌株MF04 產(chǎn)酶活力的影響Fig.8 Effect of inorganic salt ions on enzyme activity of strain MF04

2.4.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 產(chǎn)淀粉酶菌株培養(yǎng)基組分優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of optimization of medium components for amylase producing strains

結(jié)果顯示：碳源糊精（A）對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響最大，其次為無(wú)機(jī)鹽硫酸錳（C）、磷酸氫二鈉濃度（D）以及氮源（B），即 A＞C＞D＞B；對(duì)應(yīng)的最佳組合為 A2B1C3D2，即配方為 20.0 g/L 糊精，4.0 g/L 蛋白胨，10.0 g/L 硫酸錳和4.0 g/L 磷酸氫二鈉時(shí)，其產(chǎn)酶能力顯著高于其他組合，酶活力最高為56.2 U/mL。

2.4.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

初始pH 值、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速對(duì)菌株MF04產(chǎn)酶能力的影響結(jié)果見(jiàn)圖9、圖10、圖11 和圖12。

單因素結(jié)果顯示在發(fā)酵液初始pH 6.0，發(fā)酵時(shí)間為72 h，發(fā)酵溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為130 r/min 時(shí)產(chǎn)酶能力最佳，酶活力最高，達(dá)到60.2 U/mL。

圖9 初始pH 值對(duì)菌株MF04 產(chǎn)酶能力的影響Fig.9 Effect of initial pH on enzyme production capacity of strain MF04

圖10 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株MF04 產(chǎn)酶能力的影響Fig.10 Effect of culture time on enzyme production ability of strain MF04

圖11 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株MF04 產(chǎn)酶能力的影響Fig.11 Effect of culture temperature on enzyme production ability of strain MF04

圖12 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株MF04 產(chǎn)酶能力的影響Fig.12 Effect of rotation speed on enzyme production ability of strain MF04

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

將菌株MF04 接種于優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，130 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液酶活力為58.5 U/mL，與理論值接近。

3 結(jié)論

對(duì)從面粉廠、菜園以及食堂附近采集的土壤樣品中產(chǎn)淀粉酶的菌株通過(guò)平板初篩和搖瓶復(fù)篩，分離純化獲得173 株產(chǎn)淀粉酶菌株。根據(jù)H/C 比值和淀粉酶活力測(cè)定初步篩選出產(chǎn)淀粉酶能力較強(qiáng)的菌株1株，命名為MF04。通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)以及16S rDNA 鑒定，將其歸為芽孢桿菌屬蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。目前，淀粉酶工業(yè)生產(chǎn)中選用的菌株主要以枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌為主，還包括解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等[26]。利用L3（94）正交試驗(yàn)對(duì)該菌株的最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行初步優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基為：2%糊精，0.6%磷酸氫二鈉，0.5%蛋白胨和0.5%硫酸錳；最適培養(yǎng)條件為：初始pH 6.0，發(fā)酵溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速130 r/min，發(fā)酵時(shí)間72 h。在上述培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下，使菌株MF04 的產(chǎn)淀粉酶能力較優(yōu)化前提高了85.2%。

以土壤為材料進(jìn)行產(chǎn)淀粉酶菌株的分離篩選一直被研究人員關(guān)注。張麗靖等[27]從富含淀粉的土壤中篩選得到一株酸性α-淀粉酶產(chǎn)生菌B6，原始菌株產(chǎn)α-淀粉酶的酶活力達(dá)到30.2 U/mL，經(jīng)優(yōu)化后其產(chǎn)α-淀粉酶酶活力為33.4 U/mL，提高了10.6%；趙淑琴等[28]對(duì)土壤中產(chǎn)淀粉酶菌株的研究中篩選得到1 株高產(chǎn)淀粉酶菌株LZ-10，經(jīng)優(yōu)化后酶活力達(dá)到41.6 U/mL；馬曉梅等[29]對(duì)土壤中產(chǎn)淀粉酶菌株的研究中篩選得到高產(chǎn)淀粉酶菌株MSP13，經(jīng)優(yōu)化后α-淀粉酶酶活力為45.02 U/mL。而在本研究中對(duì)產(chǎn)淀粉酶菌株MF04 進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)后，可使該菌株的產(chǎn)酶活力達(dá)到60.2 U/mL，較優(yōu)化前提高了85.2%，產(chǎn)酶活力均高于同類研究。

本研究對(duì)不同土壤中的產(chǎn)淀粉酶菌株進(jìn)行分離篩選，對(duì)其中1 株產(chǎn)α-淀粉酶的菌株進(jìn)行產(chǎn)酶條件的優(yōu)化研究，使其產(chǎn)酶能力有了大幅提高，這可為淀粉酶的工業(yè)生產(chǎn)提供一定支撐。