平貝母多糖鐵配合物的合成、結構特征及 抗氧化活性

張 曼，張 宇,，徐少博，趙 宏，王宇亮，趙芷萌，孟繁玲

（1.黑龍江省新藥創(chuàng)制與藥效毒理評價重點實驗室，佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.黑龍江省第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150010）

平貝母（Fritillaria ussuriensisMaxim.）又名坪貝、北貝、東北貝母、燈籠花，為百合科平貝母的干燥鱗莖[1-2]。 我國野生平貝母主要分布于東北地區(qū)長白山脈和小興安嶺南部山區(qū)，海拔1 000 m以下的濕潤山腳坡地闊葉林帶及河谷兩岸[3]。研究表明，平貝母中含有多糖類、生物堿類、核苷類、皂苷類等多種有效成分[4-7]。多糖是藥用植物最重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老、降血糖等生物活性[8-10]。

在人體生命活動中，氧化反應是參與體內代謝過程的重要環(huán)節(jié)，氧作為最終電子受體，與未成對電子結合時就產(chǎn)生了自由基，自由基對人體的損傷主要有3 個方面：破壞細胞膜、血清抗蛋白酶失活、受損基因導致細胞突變率增加[11]。研究表明，人體內多種疾病的發(fā)生都與氧化損傷存在很大關系，隨著年齡的增長，機體對自由基的清除能力逐漸下降，從而導致機體 衰老[12]。近年來國內外學者研究發(fā)現(xiàn)，多糖作為安全性高、無毒副作用新型的天然抗氧化劑的同時，亦可作為重要的大分子載體，與Fe3+絡合后形成穩(wěn)定的鐵配合物，這類配合物具有顯著增強的抗氧化活性[13]。王明等[14]研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖鐵的抗氧化能力顯著高于枸杞多糖。萬真真等[15]研究表明，大豆多糖鐵配合物不僅溶解性增強，還可以提高清除亞硝酸鹽自由基和抑制脂質過氧化的能力。迄今為止，對平貝母多糖（F. ussuriensis polysaccharide，F(xiàn)UP）的研究主要集中于提取分離[16]等方面，關于其多糖鐵配合物的研究鮮見報道。

因此，本實驗以FUP為原料，與三氯化鐵絡合形成FUP鐵配合物（FUP-Fe），采用紫外-可見光譜、紅外光譜、X-射線粉末衍射、掃描電鏡、熱重-差熱分析等對FUP及FUP-Fe的結構進行表征和分析，并對FUP及其鐵配合物清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的能力進行研究，為FUP抗氧化劑開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平貝母于2018年9月購自哈藥集團世一堂中藥飲片有限責任公司，產(chǎn)品批號：1705005s。

透析袋（截留分子質量3 500 Da） 上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸三鈉、三氯化鐵、氫氧化鈉、鄰苯三酚、水楊酸（均為分析純） 阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇、石油醚、三氯甲烷、正丁醇、硫酸亞鐵、過氧化氫均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

DL-5-B低速多管離心機 上海安亭科學儀器廠；FA2004N型電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司； HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 蘇州威爾實驗用品有限公司；FDU-1200型冷凍干燥機 日本東京理化株式會社； RE-2000A旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；GBC10紫外-可見分光光度計 澳大利亞GBC科學儀器公司；AVATAR380傅里葉變換紅外光譜儀 美國熱電尼高力儀器公司；Rigaku MiniFlex600粉末衍射儀 日本理學 公司；Phenom ProX掃描電鏡 荷蘭飛納公司；TGS-1B熱重分析儀 瑞士梅特勒-托利多儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 FUP的提取與脫蛋白

取平貝母藥材，經(jīng)機械粉碎后，過80 目篩得粗粉，經(jīng)石油醚回流脫脂5 h，在25 ℃抽濾并在揮干溶劑后，得到脫脂后的平貝母粉。稱取脫脂后的平貝母粉50.0 g，加入500 mL雙蒸水80 ℃浸提3 h，在此條件下加熱提取2 次，過8 層紗布合并2 次水提取液，減壓濃縮，加入5 倍體積的無水乙醇，使乙醇溶液體積分數(shù)達到85%，靜置24 h，離心（25 ℃、4 000 r/min、15 min）收集沉淀，45 ℃真空干燥，即得FUP。配制10%的FUP溶液，加入1/4體積的Sevag試劑（三氯甲烷-正丁醇，4∶1，V/V）充分振蕩20 min，離心（25 ℃、4 000 r/min、15 min），保留上清液，透析48 h，重復上述操作5 次[17]。

1.3.2 FUP-Fe的制備

稱取1.0 g脫蛋白后的FUP，溶于100 mL雙蒸水中，不斷攪拌使多糖充分溶解，加入檸檬酸三鈉0.5 g，80 ℃油浴下，緩慢滴加2 mol/L FeCl3溶液，并用20% NaOH溶液調節(jié)溶液pH值為8.5，當反應溶液中生成棕紅色沉淀時，立即停止滴加NaOH和FeCl3溶液，80 ℃條件下維持攪拌1.5 h（pH 8.5），待反應完成后離心（25 ℃、4 000 r/min、15 min），取上層溶液，加入5 倍體積的無水乙醇，得到紅棕色沉淀，45 ℃真空干燥后，即得FUP-Fe[18]。

1.3.3 FUP及FUP-Fe理化性質測定

1.3.3.1 定性鑒別

參照文獻[19]中Fe3+的鑒別方法，進行定性鑒別實驗。

1.3.3.2 紫外-可見光譜分析

分別配制0.1 mg/mL的FUP和FUP-Fe的多糖溶液，以雙蒸水作為空白，用紫外-可見分光光度計進行掃描檢測，波長范圍為200～800 nm。

1.3.3.3 紅外光譜分析

取脫蛋白FUP與FUP-Fe各2 mg，按1∶1比例與KBr混合壓片，使用紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內進行光譜掃描[20]。

1.3.3.4 X-射線粉末衍射分析

將樣品鋪在樣品板上，用載玻片壓實后，置于X-射線粉末衍射儀中，采用石墨單色化Cu-Kα輻射（λ=0.154 nm），2θ測試范圍為5°～50°，掃描速 率為6°/min[21]。

1.3.3.5 掃描電鏡和能譜分析

將樣品粉末鋪到導電膠上，并用洗耳球將沒有黏在導電膠上的樣品吹掉，將導電膠置于樣品臺中，在加速電壓為15 kV的掃描電子顯微鏡中進行測試，分析其形貌特征和相應的能譜[22]。

1.3.3.6 熱重-差熱分析

分別稱取10.0 mg的FUP和FUP-Fe，以N2為保護氣，流量50 mL/min，溫度由室溫升至700 ℃，升溫速率為10 ℃/min，進行熱重和差熱分析。以溫度為X軸，以質量損失率為Y軸，繪制熱重分析曲線；以溫度為X軸，以溫度差為Y軸，繪制差熱分析曲線[23]。

1.3.4 體外抗氧化測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的測定

參照文獻[24]的方法。精密稱取0.8 mg DPPH溶于20 mL無水乙醇中，即配制質量濃度為0.04 mg/mL DPPH-乙醇溶液。分別移取6 組不同質量濃度（0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL）的FUP溶液和FUP-Fe溶液70 μL，再加入180 μL DPPH溶液，于27 ℃避光反應5 min，在517 nm波長處測定吸光度。以不含多糖樣品的DPPH溶液為空白對照組，以同質量濃度VC溶液作為陽性對照組。按式（1）計算DPPH自由基清除率：

式中：Ao為空白對照溶液的吸光度；Ai為加入樣品后吸光度。

1.3.4.2 超氧陰離子自由基的清除活性測定

在文獻[25]的方法基礎上，略作修改。配制6 組不同質量濃度的多糖溶液（0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL）， 取0.2 mL FUP溶液和FUP-Fe溶液，向其加入3 mL 0.05 mL/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）于試管中，渦旋混勻15 s，25 ℃反應10 min，在此溫度下，加入12 μL 30 mmol/L鄰苯三酚溶液反應4 min，在320 nm波長處測定吸光度。用雙蒸水調零，以同質量濃度VC溶液作為陽性對照組。按式（2）計算超氧陰離子自由基清除率：

式中：Ao為空白對照溶液的吸光度；Ai為加入樣品后的吸光度；Ab為Tris-HCl緩沖液的吸光度。

1.3.4.3 羥自由基清除能力的測定

參照文獻[26]的方法進行測定。在試管中分別加入不同質量濃度的（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、 3.2 mg/mL）FUP溶液和FUP-Fe溶液1 mL，依次加入7.5 mol/L硫酸亞鐵溶液1.5 mL，8 mmol/L水楊酸-乙醇溶液3 mL，7.5 mmol/L過氧化氫溶液3 mL，渦旋混合1 min，37 ℃反應45 min，在510 nm波長處測定吸光度。用雙蒸水調零，以同質量濃度VC溶液作為陽性對照組。清除率計算同式（1）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以上實驗所得數(shù)據(jù)經(jīng)Origin 9.1軟件處理繪圖。

2 結果與分析

2.1 FUP提取結果

平貝母經(jīng)水提醇沉后得到FUP，提取率為4.66%。

2.2 定性鑒別結果

FUP在堿性條件下與Fe3+絡合形成FUP-Fe，在此條件下可能生成Fe(OH)3，需要將Fe(OH)3與FUP-Fe溶液進行定性鑒別比較。結果顯示，F(xiàn)UP-Fe溶液中并未檢測到游離的Fe3+，表明FUP與Fe3+成功絡合，定性鑒別結 果見表1。

表 1 FUP-Fe定性鑒別結果Table 1 Qualitative identification of FUP-Fe complex

2.3 紫外-可見光譜分析結果

圖 1 FUP和FUP-Fe紫外掃描圖譜Fig. 1 UV-Vis absorption spectra of FUP and FUP-Fe complex

由圖1可知，通過紫外分光光度計200～800 nm進行全譜掃描，在波長260 nm和280 nm處未觀察到任何吸收峰，說明FUP和FUP-Fe不含有核酸、蛋白質等物質，Sevag法將此類物質基本除凈[27]。圖1顯示，F(xiàn)UP-Fe吸收峰明顯高于FUP，推測多糖結構中的羥基參與了絡合反應。

2.4 紅外光譜分析結果

圖 2 FUP和FUP-Fe紅外圖譜Fig. 2 IR spectra of FUP and FUP-Fe complex

由圖2可知，F(xiàn)UP中在3 414 cm-1處出現(xiàn)的寬峰是—OH伸縮振動的特征吸收峰。由于多糖分子具有許多羥基，分子內和分子間氫鍵的形成使其峰值特別寬。在FUP-Fe中此峰向高波數(shù)移至3 511 cm-1。FUP中2 929 cm-1為C—H伸縮振動吸收峰，在FUP-Fe中此峰移至2 932 cm-1；FUP中1 636、1 424 cm-1分別為C=O伸縮振動吸收峰和—OH彎曲振動吸收峰；而多糖結構修飾后吸收峰分別向低波數(shù)移至1 601、1 397 cm-1， FUP-Fe發(fā)生了明顯的紅移，說明多糖結構中—OH和C=O參與絡合反應。FUP結構修飾前后，紅外圖譜中特殊吸收峰未發(fā)生明顯變化，說明形成配合物后，多糖基本骨架結構未被破壞。吡喃環(huán)結構的C—O吸收峰為1 015 cm-1；α-吡喃環(huán)中C—H的變角振動吸收峰為851 cm-1；761 cm-1為D-葡萄糖環(huán)的C—O—C振動引起的吸收峰[28]。因此，說明FUP糖鏈由吡喃糖組成。

2.5 X-射線粉末衍射分析結果

圖 3 FUP和FUP-Fe的X-射線粉末衍射圖譜Fig. 3 XRD patterns of FUP and FUP-Fe complex

由圖3可知，多糖結構修飾前后圖譜基本一致，只是峰的強度略有差別，說明形成配合物后，未破壞多糖結構的基本骨架，X-射線粉末衍射分析結果與紅外圖譜分析結果基本一致。此外，F(xiàn)UP和FUP-Fe沒有呈晶體的趨勢，屬于無定型結構。

2.6 掃描電鏡和能譜分析結果

圖 4 FUP和FUP-Fe掃描電鏡圖譜Fig. 4 SEM images of FUP and FUP-Fe complex

圖4 顯示，從表面形貌看，F(xiàn)UP表面粗糙，裂紋明顯，顆粒排列松散，有很多細小空隙，與鐵離子配位后，F(xiàn)UP-Fe呈片狀，表面光滑，顆粒排列緊密，空隙較少，說明FUP與Fe3+形成了配合物。從均勻程度看，F(xiàn)UP結構修飾前，多糖顆粒大小不均，與Fe3+絡合后，配合物多糖顆粒大小比較均一。由圖5及表2可知，多糖經(jīng)修飾后，C、O含量均有降低，F(xiàn)e相對原子含量約為6.45%。且各元素分布均一，進一步證實了多糖鐵配合物的成功制備，形成穩(wěn)定的FUP-Fe。

圖 5 FUP（a）和FUP-Fe（b）能譜及元素衍射圖譜Fig. 5 Energy dispersion spectra and corresponding elemental mappings of FUP (a) and FUP-Fe complex (b)

表 2 FUP和FUP-Fe元素含量Table 2 Element contents of FUP and FUP-Fe complex

2.7 熱重-差熱分析結果

從圖6 A 可以看出，F(xiàn) U P 熱分解的第1 階段為30～170 ℃（質量損失率3.339%），此階段損失的主要是水，熱分解的第2階段為170～700 ℃（質量損失率48.15%），在170～500 ℃質量損失速度增快，說明此時多糖的化學鍵被破壞，多糖已被分解。從圖6B可以看出，F(xiàn)UP-Fe熱分解的第1階段為30～160 ℃（質量損失率1.192%），此階段損失的主要是水，熱分解的第2階段為160～700 ℃（質量損失率61.81%），在160～570 ℃質量損失速度增快，說明此時多糖配合物的化學鍵被破壞，多糖配合物已被分解。比較可知，溫度分別為500、570 ℃，質量損失速度減慢，說明FUP-Fe比FUP結構更穩(wěn)定。從圖6可知，在200～600 ℃之間，屬于2 種多糖分子結構中的分解反應，消除多糖中的羥基分子降解。FUP經(jīng)393.6 ℃和441.8 ℃ 2 個吸熱反應，683.0 ℃一個放熱反應而分解；FUP-Fe經(jīng)345.7 ℃和552.9 ℃ 2 個吸熱反應，583.1 ℃一個放熱反應分解[29]。這說明二者多糖結構存在差異，根據(jù)吸熱分解溫度看，多糖穩(wěn)定性順序為 FUP-Fe大于FUP。

圖 6 FUP（A）和FUP-Fe（B）熱重-差熱曲線圖Fig. 6 TGA-DTA curves of FUP (A) and FUP-Fe complex (B)

2.8 體外抗氧化分析結果

圖 7 FUP和FUP-Fe抗氧化能力Fig. 7 Antioxidant capacities of FUP and FUP-Fe complex

由圖7A可知，F(xiàn)UP的DPPH自由基清除活性明顯低于FUP-Fe的清除活性。隨著多糖質量濃度的增加，F(xiàn)UP-Fe對DPPH自由基清除率逐漸增強，當質量濃度為 8 mg/mL時，清除率高達68.96%。質量濃度范圍在0～4 mg/mL時，隨著FUP質量濃度的增加，清除率也隨之增強，在4～8 mg/mL范圍內，清除率基本維持在48.46%。這表明FUP-Fe能顯著提高對DPPH自由基的清除能力。

由圖7B可知，質量濃度在1～8 mg/mL范圍內，VC對超氧陰離子自由基的清除效果仍然是最佳，F(xiàn)UP的清除效果最差。在0.5～8 mg/mL范圍FUP和FUP-Fe 的清除率隨著質量濃度的增加而增強，質量濃度為 8 mg/mL時，達到最大清除率分別為30.58%和57.28%。這表明，F(xiàn)e3+的引入對超氧陰離子自由基有顯著的清除作用。

由圖7C可知，不同質量濃度的FUP和FUP-Fe對羥自由基具有的清除作用?？偟膩碚f，隨著多糖質量濃度的增加，羥自由基的清除率隨之增加，有明顯的上升趨勢。此外，F(xiàn)UP-Fe清除羥自由基的能力遠強于FUP，F(xiàn)UP-Fe對羥自由基清除率可高達46.88%。

實驗表明，在體外中許多多糖自身具有一定的抗氧化活性，經(jīng)與Fe3+絡合后的多糖，抗氧化能力顯著增加，但均低于陽性對照VC對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的清除率。景永帥等[30]合成北沙參多糖鐵配合物，并對抗氧化活性進行研究，結果表明多糖經(jīng)鐵修飾后，抗氧化活性顯著增加，這與本實驗結果一致。這可能由于多糖分子結構中有游離的—OH，引入Fe3+后，多糖羥基暴露增加，有利于捕捉自由基，從而增加其抗氧化活性[31]。

3 結 論

多糖中的醇羥基可以與金屬離子（如Fe3+）絡合，形成穩(wěn)定的多糖鐵配合物，配糖基為Fe3+，不是以游離的鐵離子形式存在，可以有效地避免對生物機體的胃腸道功能刺激作用，在機體內代謝還原成Fe2+，提高生物利用度，促進在胃腸道內的消化吸收，毒副作用小。此外，還可以有效地預防治療缺鐵性貧血癥。

因此，本研究以FUP為原料，與三氯化鐵絡合形成FUP-Fe，對FUP結構進行修飾。通過定性實驗、紫外-可見光譜、紅外光譜、X-射線粉末衍射、掃描電鏡、能譜和熱重-差熱分析等表征手段對FUP及FUP-Fe的理化性質和結構特征進行研究。結果顯示，F(xiàn)UP與Fe3+成功絡合，形成了穩(wěn)定的配合物，且其穩(wěn)定性顯著高于FUP的穩(wěn)定性。進一步對FUP及FUP-Fe的抗氧化能力測定，結果表明，F(xiàn)UP-Fe對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基有清除作用且均強于FUP。綜上所述，F(xiàn)UP經(jīng)結構修飾后，由于鐵離子的引入，可顯著提高結構穩(wěn)定性和抗氧化能力。為FUP-Fe的進一步研究提供了有效的基礎，為體內抗氧化活性提供了有效的理論依據(jù)。此外，有望開發(fā)FUP-Fe為新型保健功能的補鐵劑。