楓香擬莖點霉B3生物轉化花生廢棄物 合成白藜蘆醇

劉連紅，陳 飛，管永祥，仇美華，張 麗，戴傳超,

（1.南京師范大學生命科學學院，江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室，江蘇省微生物資源產業(yè)化工程技術研究中心， 江蘇 南京 210023；2.江蘇省農業(yè)技術推廣總站，江蘇 南京 210008；3.江蘇省耕地質量保護與環(huán)境監(jiān)測站，江蘇 南京 210008）

白藜蘆醇是一種多酚類化合物，存在于虎杖、花生、葡萄、桑葚等植物中[1]。白藜蘆醇也被認為是一種植物抗毒素，在植物受到生物或非生物脅迫時產生[2]。近年來，白藜蘆醇在醫(yī)藥及保健食品方面的應用發(fā)展引起了人們的極大興趣。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗菌消炎、調節(jié)油脂代謝、保護心臟血管等功能[3-4]，被譽為繼紫杉醇之后的又一新的綠色抗癌藥物[5]。目前，獲取白藜蘆醇的主要途徑之一是采用有機溶劑從虎杖中提取[6]，但該法提取率低且受到虎杖植物資源的限制。近幾年利用轉基因微生物生產白藜蘆醇是另一種被廣泛研究的方法[7]，但在該體系中誘導白藜蘆醇的合成不僅時限較長而且成本較高。

花生是含有白藜蘆醇的最重要的可食用植物之一，國內外有關于花生中白藜蘆醇的大量研究[8-9]。據報道，花生中含有許多對健康有益的天然活性化合物，如芪類、黃酮類、酚酸類和植物固醇類等[10-12]。目前世界花生消費一是油用，二是食用[13]。長期以來，人們僅重視花生仁的利用，而忽視花生殼、紅衣、根莖葉等利用。花生植株除了胚、上胚軸、根尖和黏液外其他各部位均含有白藜蘆醇[14]，它主要通過苯丙氨酸代謝途徑合成。花生體內可合成白藜蘆醇，植株中必然有其前體物質的大量存在，比如對香豆酸。另外，植物中白藜蘆醇一般與糖結合以白藜蘆醇苷的形式存在，近幾年，研究表明微生物可以通過分泌β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，GLU）轉化苷元合成白藜蘆醇[15-16]。因此，結合微生物轉化法探索出一條高效、綠色的生產路徑，即將花生廢棄物中的前體物質轉化為白藜蘆醇，在之后的回收過程中，將不僅回收花生廢棄物已經存在的一部分產品，還能額外增加一部分生物轉化而來的白藜蘆醇。

內生真菌是指生長于植物組織細胞間、宿主不表現(xiàn)出感染癥狀的一類真菌[17]。前期研究發(fā)現(xiàn)，接種內生真菌楓香擬莖點霉（Phomopsis liquidambari）B3可加速花生殘茬秸稈的腐解和緩解花生連作障礙[18-20]。近期全基因測序結果表明楓香擬莖點霉B3含有白藜蘆醇合成途徑中關鍵酶GLU、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate CoA ligase，4CL）和白藜蘆醇合酶（stilbene synthase，STS）的基因。因此，本研究首先通過代謝物檢測和關鍵基因的定量實驗探究楓香擬莖點霉B3利用花生廢棄物合成白藜蘆醇的初步機理。在此基礎上，利用單因素試驗和響應面法對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化使白藜蘆醇含量最大化，以期為花生廢棄物中白藜蘆醇的開發(fā)和利用提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生（Archis hypogaea）采用江西省鷹潭市常規(guī)品種贛花5號。

花生廢棄物：2016年9月收獲贛花5號花生，將花生秸稈和花生殼樣品清洗晾干，用小型高速粉碎機粉碎，即得到花生廢棄物粉末，過60 目篩備用。

內生真菌楓香擬莖點霉B3分離自大戟科植物重陽木（Bischofia polycarpam）莖內皮，保存于南京師范大學生命科學學院微生物資源與生態(tài)實驗室，馬鈴薯葡萄糖固體斜面4 ℃保藏。

白藜蘆醇、白藜蘆醇苷和對香豆酸等標準品 美國Sigma-Aldrich公司；甲醇（色譜級）和其他分析純試劑 中國江蘇漢邦科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1100型高效液相色譜儀、1290 Infinity LC/6460 QQQ MS型液相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國安捷倫有限公司；實時定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 美國Applied Biosystems公司；5 L小型發(fā)酵罐及其配件（溶解氧電極、pH電極及空氣過濾膜等配件） 上海聯(lián)環(huán)生物工程設備有限公司；6202小型高速粉碎機 北京環(huán)亞天元機械技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝

種子液培養(yǎng)基：將楓香擬莖點霉B3從馬鈴薯葡萄糖固體斜面培養(yǎng)基轉接至馬鈴薯葡萄糖液體（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)36 h用作種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方：馬鈴薯浸提液200 g/L，葡萄糖20 g/L，花生廢棄物（花生秸稈-花生殼5∶1，記作PS）50 g/L，pH 7.0，培養(yǎng)基經121 ℃高壓滅菌20 min。

為探究接種楓香擬莖點霉B3對發(fā)酵培養(yǎng)基中白藜蘆醇含量的影響，設置2 個處理：未接種B3的發(fā)酵培養(yǎng)基（CK）和接種B3的發(fā)酵培養(yǎng)基（B3）。發(fā)酵工藝：將B3種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)基初始pH 7.0、料液比1∶20（g/mL）、接種量5%（生物量（3.40±0.28）g/L）、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵轉速 150 r/min為初始條件，避光振蕩培養(yǎng)。收集樣品放置于-80 ℃過夜，使用冷凍干燥機運行24 h凍干后添加30 mL甲醇超聲輔助（100 Hz，45 ℃，30 min）提取，4 500 r/min離心15 min收集上清液，65 ℃旋蒸至干，最后用1 mL甲醇溶解備用。

1.3.2 生物轉化單因素試驗

按照1.3.1節(jié)發(fā)酵條件，以發(fā)酵培養(yǎng)基中白藜蘆醇含量為測定指標，進一步考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL））、培養(yǎng)基初始pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%、11%）、發(fā)酵溫度（20、24、28、32、36、40 ℃）和發(fā)酵轉速（90、120、150、180、210、240 r/min）對白藜蘆醇含量的影響。

1.3.3 響應面試驗優(yōu)化

根據單因素試驗結果，固定料液比1∶30（g/mL），以培養(yǎng)基初始pH值、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵轉速為試驗因素，以白藜蘆醇增量為響應值，設計4因素3水平試驗，因素與水平設計見表1。

表 1 響應面試驗因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for response surface methodology

1.3.4 發(fā)酵罐放大實驗

選取5 L發(fā)酵罐進行中試放大實驗，其中發(fā)酵條件按照響應面最終優(yōu)化條件設置培養(yǎng)基初始pH值、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵轉速，其余條件按照實際條件如通氣量1.5～3 m3/min和壓力0.7 kg/cm2培養(yǎng)48 h后放罐。

1.3.5 分析方法

1.3.5.1 花生廢棄物中物質的鑒定

質譜條件：安捷倫C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相使用甲醇（A泵）和0.2%冰醋酸（B泵）進行梯度洗脫；梯度洗脫：0～20 min，甲醇體積分數(shù)從5%上升到 50%；20～40 min，甲醇體積分數(shù)升到80%；40～80 min，甲醇體積分數(shù)升到100%；紫外吸收波長280 nm；流速0.2 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

1.3.5.2 白藜蘆醇含量的測定[21]

色譜條件：安捷倫C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外吸收波長為306 nm；柱溫30 ℃；流動相為乙腈-超純水（30∶70，V/V），流速為1 mL/min；進樣量為20 μL。

1.3.5.3 總糖和GLU活性的檢測

總糖測定采用蒽酮-硫酸比色法[22]；GLU活性測定參考Kuo等[23]方法。

1.3.5.4 關鍵酶基因表達的檢測

為確定合成過程中GLU、4CL和STS基因的轉錄水平，本實驗設置了2 個處理組：在添加花生廢棄物的PDB中接種B3（PDB+PS+B3）和未添加花生廢棄物的PDB中接種B3（PDB+B3）。在每個取樣點收集大約0.1 g真菌菌絲（濕質量），并用蒸餾水洗滌。研磨真菌菌絲并用TRIZOL試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA）取總RNA[24]。使用EasyScript RT試劑盒（TransGen Biotech）將提取的總RNA合成cDNA。使用real-time PCR儀StepOne系統(tǒng)（Applied Biosystems）進行real-time PCR。反應混合液（20 μL）包括10 μL SYBR Green探針（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (High ROX Premixe)，Vazyme）、2 μL cDNA模板和上下游引物各0.4 μL?；贐3中GLU、4CL和STS基因的部分或全長mRNA序列分別設計了特異性引物對（GLU-F-q/GLU-R-q、4CL-F-q/4CL-R-q 和STS-F-q/STS-R-q），以B3的β-actin基因作為表達水平的內參基因，具體引物對見表2。real-time PCR程序：95 ℃預變性5 min；循環(huán)反應95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)；融解曲線：95 ℃、15 s，60 ℃、60 s和95 ℃、15 s。使用標準熔解曲線驗證擴增的特異性。使用StepOne software（version 2.0，Applied Biosystems）確定熒光通過循環(huán)閾值（Ct）的周期數(shù)，這個值被用于表達水平的定量。通過2-ΔΔCt方法分析cDNA樣品的相對表達水平。每個樣品都設置3 次重復。

表 2 實驗使用引物Table 2 Sequences of oligonucleotide primers used for real-time PCR in this study

1.4 數(shù)據分析

響應面采用Design-Expert V11.0軟件，其他數(shù)據使用SPSS 16.0和Excel 2016進行分析。所有實驗數(shù)據表示為每個處理3 個重復的平均值和標準誤。數(shù)據采用SPSS 16.0軟件中的One-way ANOVA進行分析，并用Tukey多重比較不同處理組間的顯著性差異（P＜0.05，差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 接種楓香擬莖點霉B3對發(fā)酵液中白藜蘆醇含量的影響

字母不同表示差異顯著（P＜0.05），下同。

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間的延長，CK組中白藜蘆醇含量呈持續(xù)下降趨勢，這是因為白藜蘆醇不穩(wěn)定易受外界環(huán)境的影響[25]。而接種B3處理組中白藜蘆醇含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，時間從0 h延長至36 h時，白藜蘆醇含量上升至最大值38.34 μg/g，當繼續(xù)延長時間，白藜蘆醇含量開始逐漸下降至保持穩(wěn)定，這說明時間過長菌體會出現(xiàn)老化而影響白藜蘆醇合成，且與CK相比，36 h之前接種楓香擬莖點霉B3顯著加快白藜蘆醇的合成，36 h之后，B3處理組中白藜蘆醇含量顯著高于CK。因此，總體上看接種B3于36 h可顯著提高花生廢棄物中白藜蘆醇含量。

2.2 花生廢棄物中的物質鑒定

為更深入研究楓香擬莖點霉B3對白藜蘆醇生物轉化的途徑，首先需鑒定白藜蘆醇合成的前體物質。高效液相色譜-質譜分析結果揭示了花生廢棄物中2 種主要前體物質的存在，如對香豆酸和白藜蘆醇苷（圖2）。因此，推測楓香擬莖點霉B3既可分泌GLU轉化白藜蘆醇苷生成白藜蘆醇，也可分泌4CL和STS利用花生廢棄物中的對香豆酸合成白藜蘆醇，仍需進一步驗證。

圖 2 花生廢棄物中白藜蘆醇及其相關前體物質的 高效液相色譜-質譜洗脫圖Fig. 2 HPLC-MS profiles of resveratrol, luteolin and related precursors in peanut wastes

2.3 發(fā)酵液中總糖含量和GLU活性的變化

圖 3 發(fā)酵液中接種楓香擬莖點霉B3對總糖含量和GLU活性的影響Fig. 3 Evolution of total sugar content and β-glucosidase activity during fermentation of peanut wastes with P. liquidambari B3

為驗證接種B3的生長情況和GLU的分泌，每隔12 h檢測總糖和GLU活性（圖3）。結果顯示，PBD+PS+B3 處理組中總糖從12 h之后急劇下降至36 h后保持穩(wěn)定，而PBD+PS對照組無顯著性差異，表明楓香擬莖點霉B3在該時間段有最大生長速率；另外通過對GLU活性的測定，發(fā)現(xiàn)24～36 h急劇上升后保持穩(wěn)定，結果說明：楓香擬莖點霉B3在轉化過程中能夠分泌GLU，同時GLU活性依賴于B3的生長。

2.4 關鍵酶基因的表達和推測合成途徑

圖 4 楓香擬莖點霉B3中GLU（A）、4CL（B）和STS（C）的 相對表達情況Fig. 4 Relative expression levels of GLU (A), 4CL (B) and STS (C) in P. liquidambari B3

為進一步闡明楓香擬莖點霉B3合成白藜蘆醇的代謝途徑，通過real-time PCR測定不同時間點3 種關鍵酶基因的轉錄水平。圖4A顯示，PDB+B3處理組相對CK（12 h）表達水平無顯著性差異，而PDB+PS+B3處理組中GLU基因表達水平呈現(xiàn)先升后降的趨勢，總體來說，在36 h時間段內PDB+PS+B3處理組中基因的轉錄水平上調較高，結合GLU活性，說明B3在36 h內能釋放GLU轉化白藜蘆醇苷合成白藜蘆醇。另外，圖4B、C顯示，在每個時間段下，處理組中4CL和STS基因表達與CK（12 h）相比均成上調趨勢，并且在36 h時間段內4CL基因轉錄水平上調較高，而在24、36 h和48 h內的STS基因轉錄水平上調均較高，說明在該時間范圍內，STS釋放量較高，與白藜蘆醇含量變化一致，楓香擬莖點霉B3可分泌4CL和STS利用對香豆酸轉化合成白藜蘆醇?；谝陨辖Y果，推測楓香擬莖點霉B3生物轉化花生廢棄物合成白藜蘆醇的途徑見圖5，但具體途徑的轉化率尚有待進一步研究。

圖 5 楓香擬莖點霉B3生物轉化花生廢棄物合成白藜蘆醇的推測途徑Fig. 5 Speculative synthesis pathway of resveratrol from P. liquidambari B3-biotransformed peanut wastes

2.5 單因素試驗結果

圖 6 料液比（A）、培養(yǎng)基初始pH值（B）、發(fā)酵溫度（C）、 發(fā)酵轉速（D）和接種量（E）對白藜蘆醇含量的影響Fig. 6 Effects of radio of liquid to solid (A), initial pH of fermentation medium (B), culture temperature (C), rotating speed (D) and inoculum volume (E) on the content of resveratrol

接種楓香擬莖點霉B3可轉化花生廢棄物合成白藜蘆醇，因此，設計單因素試驗確定不同發(fā)酵條件的影響。圖6A表明，不同料液比條件下，CK組中白藜蘆醇含量無顯著性差異，而B3處理組中白藜蘆醇含量均提高到2 倍左右，且在料液比為1∶30時最高，達到38.96 μg/g，這可能是菌株分泌酶量有限導致。從圖6B可以看出，在不同pH值條件下，CK組中白藜蘆醇含量近乎無顯著性差異，而當pH值為中性和堿性時B3處理組中白藜蘆醇含量明顯低于酸性條件，因為花生中白藜蘆醇在酸性條件下較為穩(wěn)定，而堿性條件下易變性[26]。圖6C～E結果表明，發(fā)酵溫度、發(fā)酵轉速和接種量對白藜蘆醇含量的影響相似，表現(xiàn)為先增加后下降。原因分別為：溫度對白藜蘆醇含量的影響與菌株的溫度適應性有關[27]，即與楓香擬莖點霉B3生長的最適溫度相同（28 ℃）；在本研究采用的發(fā)酵條件中，低接種量導致細胞生長緩慢，而過大的接種量可能表現(xiàn)為細胞降解，從而導致一定時期內細胞質量的降低；白藜蘆醇含量在較高轉速下降可能是由于白藜蘆醇不穩(wěn)定或在氧氣存在下產生較低量的白藜蘆醇，因為高轉速會導致培養(yǎng)過程中的高含氧量[28]。因此綜合考慮，在料液比1∶30條件下，選取培養(yǎng)基初始pH 5.0、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵轉速210 r/min和接種量9%為響應面優(yōu)化時自變量的0水平。

2.6 響應面試驗結果

2.6.1 響應面試驗設計及結果

在各單因素試驗結果基礎上，以白藜蘆醇增量（Y）作為響應值，以培養(yǎng)基pH值（X1）、接種量（X2）、發(fā)酵溫度（X3）和發(fā)酵轉速（X4）作為自變量，建立4因素3水平的試驗設計。利用Design-Expert設計統(tǒng)計分析軟件進行Box-Behnken試驗設計，共29 組，所得結果如表3所示。采用Design-Expert V11.0軟件對數(shù)據進行方差分析，結果見表4。

表 3 響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface design with experimental results

表 4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

運用Design-Expert軟件進行多元回歸擬合，得到回歸方程如下：Y＝-713.67+97.92X1-9.05X2+23.44X3+2.03 X4+1.66X1X2-0.57X1X3+0.04X1X4+0.21X2X3+0.07X2X4+ 0.02X3X4-10.19X12-1.05X22-0.46X32-0.01X42。

從表4可看出，模擬P值小于0.000 1，表示該回歸模擬高度顯著；失擬項P值為0.119 5，不顯著，說明該回歸模型預測值與實測值有較好的擬合水平，所選模型適宜。回歸系數(shù)R2為0.907 3，表明模型較準確，試驗誤差較小，可以對試驗結果進行準確分析和預測?；貧w方程各項的方差分析表明，二次項X22顯著，X3、X12、X32和 X42極顯著。F值越大，表明對試驗指標的影響越大，結合方差分析表，對白藜蘆醇增量影響程度大小順序為發(fā)酵溫度、接種量、培養(yǎng)基初始pH值、發(fā)酵轉速。

2.6.2 響應面分析及驗證

圖 7 任意兩變量對白藜蘆醇增量影響的響應面和等高線圖Fig. 7 Contour and response surface plots showing the interactive effects of various variables on increasing resveratrol content

等高線的形狀不同，交互效應的強弱也不同。交互項的等高線圖越近似橢圓形，表明交互作用越強[29]。由圖7可以看出，3 組交互作用中，培養(yǎng)基初始pH值與接種量的交互作用最強，其次是接種量與發(fā)酵轉速的交互作用，而發(fā)酵溫度和發(fā)酵轉速的交互作用最弱。

從響應面圖可看到擬合曲面有最大值，對擬合方程求偏導，可得出模型最大值，即為最優(yōu)方案[30]。通過對二次多項式數(shù)學模型的解逆矩陣，得出白藜蘆醇增量最高的最佳條件為培養(yǎng)基初始pH 5.167、接種量9.097%、發(fā)酵溫度28.632 ℃、發(fā)酵轉速203.643 r/min，預測白藜蘆醇增量為40.555 μg/g。結合實際操作情況，將發(fā)酵條件修正為培養(yǎng)基初始pH 5.2、接種量9%、發(fā)酵溫度28.6 ℃、發(fā)酵轉速204 r/min，在此條件下進行3 次實驗，計算平均值為39.73 μg/g，該結果與模型預測值基本一致，相對誤差為2.024%，說明該模型對試驗具有一定的實際指導意義。后續(xù)實驗為了擴大發(fā)酵規(guī)模，選取5 L發(fā)酵罐進行中試放大實驗。從圖8可知，隨著發(fā)酵時間的延長，白藜蘆醇含量逐漸增加，到第36小時達到最大值111.78 μg/g，與未接種楓香擬莖點霉B3時相比，白藜蘆醇含量提高了1.9 倍。總糖含量逐步下降，說明菌絲要先消耗掉葡萄糖后，才能產生合成酶，從而利用白藜蘆醇苷和對香豆酸產生白藜蘆醇。pH值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，這可能是因為發(fā)酵前期氨基酸等物質不斷釋放造成酸性條件，直至36 h合成大量白藜蘆醇，隨后菌體生長能力下降釋放胞內一些堿性物質導致pH值逐漸上升。因此36 h為最佳發(fā)酵時間。

圖 8 花生廢棄物發(fā)酵罐各跟蹤指標Fig. 8 Time courses of fermentation of peanut wastes in a 5 L fermentor

3 結 論

本研究表明，內生真菌楓香擬莖點霉B3既可以通過分泌糖苷酶轉化花生廢棄物中的白藜蘆醇苷為白藜蘆醇，又可以通過從頭合成途徑利用花生廢棄物中的對香豆酸生產白藜蘆醇。其中，兩條途徑具體途徑的轉化率尚有待進一步研究。本研究在單因素試驗的基礎上，對搖瓶試驗中內生真菌B3生物轉化花生廢棄物合成白藜蘆醇的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。建立了pH值、接種量、發(fā)酵溫度和轉速對發(fā)酵液中白藜蘆醇含量的二次回歸方程模型，經驗證，該數(shù)學模型可靠，可以用于發(fā)酵液中白藜蘆醇含量的預測。結合單因素試驗和響應面優(yōu)化模型的結果來看，在料液比1∶30（g/mL）、培養(yǎng)基初始pH 5.2、接種量9%、發(fā)酵溫度28.6 ℃、發(fā)酵轉速204 r/min條件下，發(fā)酵液中白藜蘆醇含量提高了39.73 μg/g。在此最優(yōu)條件下，在5 L發(fā)酵罐進行中試放大實驗，結果顯示發(fā)酵36 h白藜蘆醇含量提高了1.9 倍。因此開發(fā)花生廢棄物中的白藜蘆醇不僅不會造成像虎杖中那樣“與藥爭源”的矛盾，而且對于提高花生的價值將更加有意義。