鹽脅迫促進(jìn)鼠李糖乳桿菌富硒的效果

徐 穎，鄔淑芳，楊芙蓮，余海霞，賀佳璇

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

硒是人體必需的微量營(yíng)養(yǎng)素，隨著人們對(duì)硒營(yíng)養(yǎng)功能的研究發(fā)現(xiàn)，硒不僅是谷胱甘肽過氧化物酶、硒磷酸酯合成酶等酶活性中心的組成成分，還具有保護(hù)心血管和心肌的健康、增強(qiáng)免疫功能、防癌抗癌、重金屬的天然解毒劑等作用，并且能促進(jìn)身體生長(zhǎng)、保護(hù)視覺器官[1-4]。 硒的補(bǔ)充主要有無機(jī)硒和有機(jī)硒兩種形式，有機(jī)硒相比無機(jī)硒，安全性相對(duì)較高，不易發(fā)生硒中毒，也容易被機(jī)體吸收利用[5]。

有益微生物對(duì)于硒的富集和轉(zhuǎn)化是當(dāng)前乃至以后研究的方向。Sarathchandra等[6]研究巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）富硒效果，發(fā)現(xiàn)生成了紅色硒單質(zhì)。此外，深紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）[7]、 大腸桿菌（Escherichia coli）[7]、印度脫硫元螺菌（Desulfurispirillum indicum）[8]、酵母菌[9]、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）[10]等也具有將亞硒酸鹽或硒酸鹽轉(zhuǎn)化為硒單質(zhì)的能力。乳酸菌同樣具有將無機(jī)硒生物轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒的功能[11-14]，相對(duì)于化學(xué)法，操作簡(jiǎn)便、安全，但存在富硒量偏低的問題。所以，本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，探討鹽脅迫對(duì)鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus）富硒效果的影響，提高鼠李糖乳桿菌富硒量，探索其作用機(jī)制，以期對(duì)富硒乳酸菌在乳品工業(yè)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌ATCC 53103由實(shí)驗(yàn)室提供；亞硒酸鈉 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；MRS培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722E型分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；臺(tái)式 低速離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；PB-10酸度計(jì) 德國(guó)賽多利斯公司；H-7650透射電子顯微鏡 日本日立公司；EDAX透射電鏡專用能譜儀 美國(guó)伊達(dá)克斯有限公司；IRIS Intreid II電感耦合等離子發(fā)射光譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；FD5-series真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Freeze Dryer公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

將0.3～0.5 mL經(jīng)高溫高壓滅菌后的MRS肉湯培養(yǎng)基注入該菌凍干管中，用移液槍輕輕吹打，使之充分溶解成菌懸液。將菌懸液移入試管，37 ℃活化培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3 代，作為供試菌液。

1.3.2 鹽脅迫富硒培養(yǎng)

一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl溶液、0.17 mg/mL亞硒酸鈉溶液和MRS液體培養(yǎng)基預(yù)先滅菌，將供試菌液以1%接種量接種于液體培養(yǎng)基中，15 mL培養(yǎng)基加入1 mL亞硒酸鈉和1 mL NaCl溶液，使亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為10 μg/mL，同時(shí)做空白對(duì)照，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)72 h，采用比濁法，每隔3 h取出在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制各菌種生長(zhǎng)曲線，觀察菌體生長(zhǎng)情況，以確定鹽脅迫富硒培養(yǎng)的時(shí)間。

1.3.3 富硒培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.3.1 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

2%、4%、6%、8% NaCl溶液和0.17 mg/mL亞硒酸鈉溶液、MRS液體培養(yǎng)基預(yù)先滅菌，將供試菌液以1%接種量接種于不同含鹽量富硒液體培養(yǎng)基中，以富硒不加鹽脅迫為的空白對(duì)照，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h，觀察菌體顏色變化，用生理鹽水充分洗滌，離心得菌泥，測(cè)定菌體富硒率和富硒量。

1.3.3.2 pH值的選擇

配制pH值分別為5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2的MRS液體培養(yǎng)基和0.17 mg/mL亞硒酸鈉溶液、6% NaCl溶液并預(yù)先滅好菌，將供試菌液按1%接種量接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h，用生理鹽水充分洗滌，離心得菌泥，測(cè)定菌體富硒量和富硒率。

1.3.3.3 培養(yǎng)溫度的選擇

配制一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl溶液、0.17 mg/mL亞硒酸鈉溶液和pH值為最佳值MRS液體培養(yǎng)基并預(yù)先滅菌，將供試菌液以1%接種量接種于含最佳NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)富硒液體培養(yǎng)基中，分別在35、37、39、41、43 ℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)48 h。離心得菌泥，測(cè)定菌體富硒量和富硒率。

1.3.4 富硒量的測(cè)定

菌液離心得菌體， 烘干后用硝酸- 高氯酸 （5∶1，V/V）混酸消化，方法詳見文獻(xiàn)[15]。樣品用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀測(cè)定。富硒量和富硒率按 式（1）、（2）計(jì)算：

1.3.5 透射電鏡觀察富硒菌體

富硒后菌體離心，用2.5%戊二醛-多聚甲酸固定液4 ℃固定2 h，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液浸洗30 min；1%四氧化鋨固定液4 ℃固定2 h，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液10 min；依次用30%、50%、70%、90%乙醇、無水乙醇脫水；用包埋劑（Epon812-丙酮1∶1）37 ℃浸泡2 h，再用包埋劑60 ℃浸泡0.5～1 h；37 ℃聚合12 h，超薄切片50～70 nm；用醋酸鈾、檸檬酸鉛染色各10 min。用透射電鏡觀察，用能譜儀打能譜。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫富硒鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)曲線

如圖1所示，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組比空白組進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間推后3 h左右，這是由于在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（3～12 h）菌體的生長(zhǎng)一定程度上受到鹽脅迫和硒的抑制，但進(jìn)入穩(wěn)定期后各組的差異逐漸縮小，6% NaCl溶液脅迫條件下富硒培養(yǎng)24 h，活菌數(shù)接近空白組，且比未受鹽脅迫組的活菌數(shù)高。說明6% NaCl溶液脅迫雖然對(duì)菌前期生長(zhǎng)有些影響，但是進(jìn)入穩(wěn)定期后影響不大，可以開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 1 鼠李糖乳桿菌受6% NaCl溶液脅迫的生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curve of L. rhamnosus under 6% NaCl stress

2.2 鹽脅迫工藝條件對(duì)鼠李糖乳桿菌富硒效果的影響

2.2.1 培養(yǎng)時(shí)間的影響

圖 2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)富硒量（a）和富硒率（b）的影響Fig. 2 Effect of culture time on selenium content (a) and enrichment efficiency (b)

由圖2可知，用6% NaCl溶液脅迫鼠李糖乳桿菌，24 h內(nèi)隨菌的生長(zhǎng)，富硒量和富硒率快速增大，但受6% NaCl溶液脅迫組與未受鹽脅迫組富硒作用差異不大；培養(yǎng)24 h后，菌體處于穩(wěn)定期，富硒量和富硒率變化緩慢，趨于穩(wěn)定，但受6% NaCl溶液脅迫組與未受鹽脅迫組富硒作用差異逐漸增大?？傊w的富硒作用與其生長(zhǎng)同步進(jìn)行。48 h后，富硒量和富硒率波動(dòng)變小，因此確定培養(yǎng)時(shí)間為48 h。此時(shí)6% NaCl溶液脅迫組比未脅迫組的富硒量提高了122.72 μg/g，富硒率提高了13.17%，明顯促進(jìn)了鼠李糖乳桿菌的富硒效果。

2.2.2 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖3可知，未脅迫組的富硒量和富硒率分別為329.71 μg/g和30.16%，6% NaCl溶液脅迫組的富硒量和富硒率高于未脅迫組，能提高鼠李糖乳桿菌的富硒效果，且在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%時(shí)富硒量和富硒率達(dá)最高值。

圖 3 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)富硒效果的影響Fig. 3 Effect of salt concentration on selenium content and enrichment efficiency

2.2.3 培養(yǎng)pH值的影響

圖 4 pH值對(duì)富硒量（a）和富硒率（b）的影響Fig. 4 Effect of pH on selenium content (a) and enrichment efficiency (b)

由圖4 可以看出，用6% N a C l 溶液脅迫富硒，pH 5.6～6.4時(shí)，富硒量和富硒率呈現(xiàn)不同程度的遞增，但是在pH 6.4～7.2時(shí)，富硒量和富硒率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說明pH值大于6.4有明顯抑制菌體富硒的作用，可能是因?yàn)閜H值大于6.4后，對(duì)酶活力有影響，影響硒蛋白的合成，從而抑制菌體富硒作用，所以鹽脅迫富硒培養(yǎng)的最佳pH值為6.4。

2.2.4 培養(yǎng)溫度的影響

由圖5可知，富硒培養(yǎng)受溫度變化影響比較明顯，在6% NaCl溶液脅迫富硒培養(yǎng)條件下，37 ℃時(shí)呈現(xiàn)最大值，只富硒不進(jìn)行鹽脅迫培養(yǎng)條件下39 ℃時(shí)出現(xiàn)最大值，可能是由于37 ℃是鼠李糖乳桿菌的最佳生長(zhǎng)溫度，加鹽改變細(xì)胞通透性使富硒量增加，不加鹽時(shí)溫度升高造成細(xì)胞的損傷，所以溫度過高時(shí)富硒量反而減少。因此，鼠李糖乳桿菌在進(jìn)行鹽脅迫富硒培養(yǎng)效果較好的溫度為37 ℃。

圖 5 培養(yǎng)溫度對(duì)富硒量（a）和富硒率（b）影響Fig. 5 Effect of culture temperature on selenium content (a) and enrichment efficiency (b)

2.3 透射電鏡觀察

圖 6 鼠李糖乳桿菌富硒前后形貌及能譜對(duì)比Fig. 6 Comparison of morphology and energy spectra of native and Se-enriched L. rhamnosus

富硒后的菌體細(xì)胞內(nèi)有黑色微小球形顆粒分布 （圖6B1），鹽脅迫富硒后的菌體細(xì)胞內(nèi)外均有黑色微小球形顆粒分布，顆粒數(shù)較單純富硒的情況多，并且在細(xì)胞外的顆?？梢杂坞x存在，顆粒大小20～60 nm（圖6C1）。 Wadhwani等[16]指出大概有30多種原核微生物能把無機(jī)硒轉(zhuǎn)化成硒單質(zhì)，顆粒大小主要集中在20～200 nm，顆粒大小與富硒培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。本次觀察到的顆粒大小正好位于其間。經(jīng)能譜分析，空白組硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%（圖6A2），富硒未脅迫組硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.42% （圖6B2），鹽脅迫富硒組硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.72%（圖6C2）。 說明亞硒酸鈉能夠進(jìn)入到菌體內(nèi)，被還原生成硒單質(zhì)，有一部分留在細(xì)胞內(nèi)，另外還有一部分被分泌到細(xì)胞外，并且可以游離存在，菌體受鹽脅迫后富硒量增加，進(jìn)一步證明了鼠李糖乳桿菌具有生物轉(zhuǎn)化無機(jī)硒的作用。

3 討 論

具有富硒能力的乳酸菌有鼠李糖乳桿菌[17]、副干酪乳桿菌[17]、保加利亞乳桿菌[18]、干酪乳桿菌[19]、羅伊氏乳桿菌[20-21]、耐久腸球菌[22]等。靳志強(qiáng)等[23]研究了動(dòng)物雙歧桿菌01的耐硒特性和最佳富硒條件，其菌體硒含量達(dá)898.0 μg/g，富硒率為28.1%。曾議霆等[24]對(duì)5 種15 株乳酸菌進(jìn)行富硒培養(yǎng)并篩選，最終篩選出1 株植物乳桿菌BC-25為富硒優(yōu)勢(shì)菌株，富硒量425.8 μg/g，富硒率達(dá)27.0%。文獻(xiàn)[23]中動(dòng)物雙歧桿菌01的富硒量雖然高于本研究的鼠李糖乳桿菌，但其富硒率較低。文獻(xiàn)[24]篩選出的植物乳桿菌的富硒量和富硒率均低于于本研究的鼠李糖乳桿菌。

硒酸鹽或亞硒酸鹽在微生物中被還原成硒單質(zhì)，可以看成是脫毒的過程，同時(shí)作為電子的受體，維持氧化還原穩(wěn)定狀態(tài)[25]。谷胱甘肽在亞硒酸還原中起電子供體的作用，其還原產(chǎn)物是硒代谷胱甘肽（GS-Se-SG），它是谷胱甘肽還原酶和細(xì)菌硫氧還蛋白還原酶的底物。谷胱甘肽還原酶或細(xì)菌硫氧還蛋白還原酶還原GS-Se-SG產(chǎn)生谷胱甘肽硒硫化物（GS-Se—），其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為還原型谷胱甘肽和Se0。谷胱甘肽再生的電子源是NADPH。Butler等[26]報(bào)道硒納米球分泌到細(xì)胞外過程中起作用的是SefA（硒因 子A），它的分子質(zhì)量約為95 kDa，沒有可切割的信號(hào)肽。

楊鶴[27]發(fā)現(xiàn)NaCl能提高乳酸菌的富硒能力，和本課題組的研究結(jié)果一致。乳酸菌能將培養(yǎng)液中的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化成其所需要的硒代半胱氨酸[28]，進(jìn)一步合成各種含硒酶類，維持機(jī)體正常代謝，當(dāng)乳酸菌受到鹽脅迫時(shí)，為應(yīng)對(duì)外界滲透壓的變化，通過誘導(dǎo)相關(guān)酶（包括硒蛋白酶）表達(dá)上調(diào)，增加谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和甜菜堿等可混溶性溶質(zhì)的生成量，這些可混溶性溶質(zhì)能防止由于外部高滲透壓而引起的細(xì)胞內(nèi)水分損失，確保細(xì)胞內(nèi)外的溶脹平衡，維持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[29]。而這些可混溶性溶質(zhì)生物合成的關(guān)鍵酶如甘氨酸還原酶、脯氨酸還原酶、甜菜堿還原酶都是硒蛋白酶，因此鹽脅迫促進(jìn)了乳酸菌對(duì)硒的轉(zhuǎn)化作用。

4 結(jié) 論

以1 株富硒能力較強(qiáng)的鼠李糖乳桿菌（ATCC 53103）為研究對(duì)象，利用電感耦合等離子發(fā)射光譜方法測(cè)定鼠李糖乳桿菌的富硒量和富硒率，研究鹽脅迫富硒過程中培養(yǎng)時(shí)間、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、培養(yǎng)溫度對(duì)菌體細(xì)胞富硒效果的影響，結(jié)果表明，15 mL培養(yǎng)基中加入1 mL 6% NaCl溶液、pH 6.4、溫度37 ℃時(shí)，鼠李糖乳桿菌富硒培養(yǎng)48 h效果較好，富硒量最高可達(dá)452.43 μg/g，富硒率最高達(dá)43.33%，利用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌富硒后形成微小硒納米顆粒，且鹽脅迫能促進(jìn)其富硒效果。