,*,4,*

(1.復旦大學藥學院,上海 200120;2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院,上海 201203;3.上海師范大學生命科學學院,上海 200234;4.上海交通大學藥學院,上海 200240)

伊立替康(irinotecan,CPT-11)是一種衍生自喜樹堿的化合物,廣泛應用于各類腫瘤疾病治療,如非小細胞肺癌、胃癌和直腸癌等[1]。CPT-11進入體內后能迅速在胃腸道和肝臟組織中水解為活性化合物SN-38,SN-38在肝葡萄糖醛酸化過程中代謝為無活性代謝物SN-38葡糖苷酸(SN-38G),隨后被輸出到腸道[2]。但是,SN-38G可被腸道細菌β-D-葡糖醛酸糖苷酶水解為SN-38,從而導致腸毒性[3]。研究表明[4],CPT-11還會造成脊髓抑制毒性、中性粒細胞和白細胞減少等不良反應。

雙歧桿菌是活的腸道微生物,作為藥物或食品補充劑有助于維持人類或其他宿主消化道的微量平衡,并且可以通過自身轉化吸收微量元素,改變生理生化功能[5]。研究表明[6],益生菌制劑具有低毒性、良好的耐受性等優(yōu)點,可通過降低腸道β-D-葡糖醛酸糖苷酶的活性,緩解伊立替康治療引起的腹瀉。微量元素硒(selenium,Se)是人體必需元素,與蛋白質組成硒蛋白維持生理功能,與25-30種遺傳特異性酶組成硒酶維持催化功能,在生物化學和生理學上具有重要作用[7]。研究表明[8-9],有機硒具有顯著的低毒性和可接受的生物利用度,可作為化療預防劑,以防止抗癌藥物伊立替康的毒性,并協(xié)同增強體外和體內的抗腫瘤治療效果。據此,本實驗室在高硒培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)雙歧桿菌,通過特定條件使培養(yǎng)基中的無機硒吸收轉化為自身硒蛋白,制備具備硒功能和雙歧桿菌功能的富硒益生菌(Selenium-enrichedBifidobacteriumlongum,Se-DD98)。研究表明[10],雙歧桿菌經富硒培養(yǎng)后,黏附能力顯著提升,且可能與細菌表面Tuf黏附蛋白的改變有關。

有研究表明[11-13],富硒益生菌可影響體內硒蛋白基因表達、免疫功能、和谷胱甘肽過氧化酶的活性,并且與CPT-11聯用后可以增強抗腫瘤作用。富硒長雙歧桿菌可降低CPT-11誘導的小鼠死亡率并預防小鼠小腸黏膜炎[14]。本實驗室前期研究表明,Se-DD98能夠改善5-FU導致的化療性腸黏膜炎[15]。CPT-11的嚴重不良反應限制了其臨床應用,因此本研究旨在探討Se-DD98輔助用藥后對CPT-11所致不良反應的緩解作用,包括對小鼠體重、腹瀉等級、免疫指標和腸道菌群的影響,為后期研究和開發(fā)活性更優(yōu)的新型富硒益生菌產品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

48只健康雄性SPF級ICR小鼠 6～8周齡,體質量(20±2) g,由上海杰思捷實驗動物有限公司提供,實驗動物許可證號:SCXK(滬)2014-0018,普通飼料適應性喂養(yǎng)3 d,飼養(yǎng)溫度21-25 ℃,相對濕度40%～70%;長雙歧桿菌DD98菌株(CGMCC 16573) 本實驗室經高通量篩選得到耐硒長雙歧桿菌優(yōu)勢菌株[16],經16S rRNA測序及核苷酸序列BLAST分析,結果表明DD98菌株是一種新的長雙歧桿菌;鹽酸伊立替康原料藥 齊魯制藥;二甲基亞砜 國藥集團化學試劑有限公司;糞便基因DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司;亞硒酸鈉 山東西亞化學工業(yè)有限公司;BBL瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限公司。

ALC-210.3電子天平 賽多利斯有限公司;AG22331 Hamburg離心機 艾本德;Forma 900系列超低溫冰箱 賽默飛世爾;XH-C漩渦混合器 金壇市白塔新寶儀器廠;AJD14L010臺式高速冷凍離心機 貝克曼庫爾特;DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科學儀器有限公司;1510全波長酶標儀 賽默飛世爾;LGJ-22D冷凍干燥劑 北京四環(huán)科學儀器廠有限公司;BC-2800vet全自動血液細胞分析儀 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 Se-DD98的培養(yǎng):前期實驗研究結果表明[17],將長雙歧桿菌DD98接種于BBL瓊脂培養(yǎng)基中,厭氧培養(yǎng)12 h后,向培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉,繼續(xù)培養(yǎng)至24 h,在高硒環(huán)境下發(fā)酵可制備得到Se-DD98。Se-DD98冷凍干燥48 h后得到凍干菌粉,密封保存于4 ℃,實驗前采用平板涂布法檢測樣品活菌數。參照食品安全國家標準,測定菌粉Se-DD98的硒含量為0.349 mg/g(硒重量/菌粉重量)。

給藥溶液的配制:高劑量菌液(菌液活菌數1×109CFU/kg)配制:平板涂布法測得菌粉活菌數為5.196×108CFU/g(菌粉重量),根據小鼠灌胃體積0.2 mL/10 g(小鼠體重),最終確定配制溶液濃度為0.096 g/mL,使用無菌蒸餾水溶解菌粉。低劑量菌液(菌液活菌數1×108CFU/kg)配制:使用梯度稀釋法,用無菌蒸餾水將高劑量菌液稀釋10倍,得到低劑量菌液。

1.2.2 動物分組及給藥 小鼠隨機分為4組,每組12只,分別為正常對照組、CPT-11組、Se-DD98低劑量組、Se-DD98高劑量組。正常對照組和CPT-11組灌胃蒸餾水,Se-DD98低劑量組灌胃低劑量菌液(菌液活菌數1×108CFU/kg),Se-DD98高劑量組灌胃高劑量菌液(菌液活菌數1×109CFU/kg),灌胃體積0.2 mL/10 g(小鼠體重),1次/d。

參照文獻方法[18],建立伊立替康小鼠腹瀉模型。第0～24 d,各組小鼠灌胃無菌蒸餾水或者菌液;第18 d,正常對照組腹腔注射無菌生理鹽水,其余各組每只小鼠腹腔注射150 mg/kg CPT-11,注射體積0.1 mL/10 g(小鼠體重);第17 d和第24 d,每組各取6只小鼠,考察生理生化指標及腸道菌群變化;第18～24 d,觀察各組小鼠腹瀉情況。

表2 qRCR引物設計和反應體系Table 2 qPCR primer design and reaction system

1.2.3 小鼠體重 實驗開始后分別于第18、19、20、21、22、23、24 d每天早上9:00觀察小鼠狀態(tài),測量各組小鼠體重并記錄[19],按照公式(1)計算各組小鼠原始體重百分比。

原始體重百分比(%)=Wn/W0×100

式(1)

式中:Wn:第n(0～24) d各組小鼠體重;W0:第0 d各組小鼠體重。

1.2.4 小鼠腹瀉發(fā)生率和腹瀉等級評價 參考文獻方法[20],伊立替康注射24 h后,分別在24、48、72、96、120和144 h觀察小鼠腹瀉情況并進行腹瀉評分(表1),按照公式(2)和(3)分別計算各組小鼠腹瀉發(fā)生率和小鼠平均腹瀉等級。

腹瀉發(fā)生率(%)=(N/N0)×100

式(2)

式中:N:各組小鼠腹瀉只數;N0:各組小鼠總只數。

平均腹瀉等級=M/N0

式(3)

式中:M:各組小鼠腹瀉等級之和;N0:各組小鼠總只數。

表1 小鼠腹瀉評價標準Table 1 Diarrhea evalution criteria in mice

1.2.5 小鼠脾臟指數和外周血常規(guī)指標測定 第17和24 d,各組小鼠隨機取出6只并稱重,采用眼內眥法采集血液至含肝素的抗凝管中,上下顛倒混勻,在2 h內使用全自動血液細胞分析儀檢測外周血常規(guī)。所有操作步驟都需要嚴格按照相關規(guī)定進行,以保證檢測結果的準確性。對比分析外周血常規(guī)檢測結果,包括白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞。

第17 d和第24 d,采用頸椎脫臼法處死小鼠,冰上操作,取出脾臟并稱重,按照公式:臟器指數=臟器質量(mg)/體質量(g)計算脾臟指數。

1.2.6 小鼠腸道微生物相對豐度測定 第17 d和第24 d,采用頸椎脫臼法處死小鼠,冰上操作,取出0.2 g盲腸內容物裝入干凈的EP管中,放入-80 ℃冰箱凍存。使用糞便基因DNA提取試劑盒提取糞便總DNA,超微量紫外分光光度計測定DNA濃度并稀釋。參照文獻方法[21-23],使用熒光定量qPCR測定擬桿菌、長雙歧桿菌、梭菌和大腸桿菌的相對豐度,CT檢測限為40個循環(huán)(表2和表3)。

表3 qPCR反應條件Table 3 qPCR reaction conditions

1.2.7 小鼠回腸組織結構的觀察 采用蘇木精-伊紅(Hematoxylin and eosin,HE)染色法分別于第17 d和第24 d,采用頸椎脫臼法處死小鼠,距回盲瓣5 cm處獲取回腸組織,0.9%生理鹽水沖洗干凈,福爾馬林固定24 h。將石蠟組織切片脫蠟至水,水洗3次,每次2 min;將切片置于蘇木素液中浸染5 min,之后水洗1 min;鹽酸酒精分化30 s之后,流水沖洗5 min;伊紅染液浸染3 min,之后流水沖洗30 s;逐級乙醇脫水,最后用二甲苯透明,中性樹膠封片固定后,于光學顯微鏡下觀察。

1.3 數據處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩組之間的差異采用t-test進行顯著性分析。結果表示為平均值±標準差,P<0.05表示存在顯著性差異,P<0.01表示存在極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 小鼠體重變化

實驗數據顯示,伊立替康組、Se-DD98低劑量組和高劑量組小鼠的原始體重百分比在第18 d注射伊立替康后均呈現先下降后回升的趨勢(圖1)。

表4 小鼠在18 d到24 d的原始體重百分比Table 4 Percentage of initial mouse body weight from the 18 d to the 24 d

圖1 小鼠原始體重百分比變化Fig.1 Changes of percentage of initial mouse body weight

注：與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與伊立替康組比較,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01;與低劑量比較,#P<0.05,##P<0.01。表5～6同。

由表4可知,與正常對照組比較,注射伊立替康后,伊立替康組、Se-DD98低劑量組和高劑量組的原始體重百分比均顯著降低(P<0.05)。但與伊立替康組比較,Se-DD98低劑量組的原始體重百分比在18～19 d顯著降低(P<0.05),在23和24 d顯著升高(P<0.05);與伊立替康組比較,Se-DD98高劑量組的原始體重百分比在18 d極顯著降低(P<0.01),在20 d以后均極顯著升高(P<0.01);且Se-DD98高劑量組的原始體重百分比顯著高于低劑量組(P<0.05)。結果表明,伊立替康會造成小鼠體重下降,而長期給予Se-DD98菌粉能夠抑制伊立替康造成的體重下降,并且存在劑量依賴性。

表5 Se-DD98 對伊立替康所致腹瀉小鼠平均腹瀉等級的影響Table 5 Effect of Se-DD98 on average diarrhea levels in diarrhea mice induced by irinotecan

2.2 Se-DD98對小鼠腹瀉發(fā)生率和平均腹瀉等級的影響

研究表明,伊立替康誘導的高腹瀉發(fā)生率將影響藥物的臨床治療,并且嚴重的腹瀉等級也會致使脫水等生命危險[24]。伊立替康組腹瀉發(fā)生率隨著時間增加呈現先逐漸上升,后期下降后保持不變的趨勢。Se-DD98低劑量組在96 h下降后保持不變,Se-DD98高劑量組在48 h下降后保持不變,但Se-DD98高、低劑量組的腹瀉發(fā)生率均低于伊立替康組(圖2)。

圖2 Se-DD98對伊立替康所致腹瀉小鼠腹瀉發(fā)生率的影響Fig.2 Effect of Se-DD98 on diarrhea incidencein diarrhea mice induced by irinotecan

伊立替康組和Se-DD98高、低劑量組的平均腹瀉等級也顯示隨時間而變化,出現先升高后下降的現象。伊立替康組在各時間點的平均腹瀉等級均顯著高于正常對照組(P<0.05)。Se-DD98低劑量組在144 h,Se-DD98高劑量組在72～144 h的平均腹瀉等級均顯著低于伊立替康組(P<0.05)(表5)。結果表明,伊立替康會導致小鼠不同程度的腹瀉且平均腹瀉等級呈現先升高后下降的現象,給予Se-DD98菌粉能夠降低小鼠腹瀉發(fā)生率和平均腹瀉等級。由此推知,Se-DD98能夠緩解伊立替康所致的小鼠持續(xù)腹瀉。

2.3 Se-DD98對小鼠免疫指標的影響

研究認為,雙歧桿菌對正常小鼠免疫功能影響的水平低于其對免疫功能低下小鼠模型各項免疫指標的影響[25];與單獨給予硒或者單獨給予益生菌比較,富硒益生菌具有更多優(yōu)勢,能夠增強環(huán)磷酰胺治療的荷瘤小鼠的免疫功能[12,26]。由表6可知,第17 d(伊立替康注射前),各組小鼠的脾臟指數、白細胞指數、淋巴細胞指數和中性粒細胞指數均沒有顯著差異。第24 d(伊立替康注射后),與正常對照組比較,伊立替康組的脾臟指數和白細胞數目均極顯著降低(P<0.01)。與伊立替康組比較,Se-DD98低劑量組的脾臟指數和中性粒細胞指數均顯著升高(P<0.05),Se-DD98高劑量組的脾臟指數、白細胞指數和中性粒細胞均顯著升高(P<0.05)。結果表明,伊立替康注射前,長期給予Se-DD98菌粉對正常小鼠免疫功能沒有明顯的影響。伊立替康注射后造成小鼠免疫功能下降,Se-DD98菌粉能夠提高小鼠免疫功能。由此推知,Se-DD98菌粉對正常小鼠免疫功能影響甚微,但能抑制伊立替康所致的機體免疫功能下降,具有調節(jié)機體免疫功能的作用。

表6 Se-DD98對伊立替康所致腹瀉小鼠免疫指標的影響Table 6 Effect of Se-DD98 on immune indexes in diarrhea mice induced by irinotecan

圖3 Se-DD98對小鼠腸道菌群相對豐度的影響Fig.3 Effect of Se-DD98 on relative abundance of intestinal microflora in mice 注:A:梭菌;B:大腸桿菌;C:擬桿菌;D:雙歧桿菌。與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與伊立替康組比較,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01;與低劑量比較,#P<0.05,## P<0.01。

2.4 Se-DD98對小鼠腸道菌群的影響

研究表明[23,27-28],擬桿菌、梭菌和大腸桿菌能夠增強β-D-葡糖醛酸糖苷酶的活性,促使腸道內非活性化合物SN-38G轉化為活性化合物SN-38,從而加劇小鼠腹瀉。Kulkarni課題組研究表明[29],飲食中的長雙歧桿菌能夠影響某些與β-D-葡糖醛酸糖苷酶相關的腸道微生物菌群的代謝活性。

第17 d(伊立替康注射前),與正常對照組比較,Se-DD98高、低組的大腸桿菌和擬桿菌相對豐度顯著減少(P<0.05);而雙歧桿菌相對豐度顯著增加(P<0.01)。有研究表明,益生菌制劑減少正常小鼠糞便中大腸桿菌等有害菌含量,增加雙歧桿菌等有益菌含量[30]。由此推知,長期給予Se-DD98,能夠增加正常小鼠糞便雙歧桿菌等有益菌含量,減少梭菌、大腸桿菌和擬桿菌的含量。

第24 d(伊立替康注射后),與正常對照組比較,伊立替康組的梭菌和擬桿菌顯著增加(P<0.01),大腸桿菌和雙歧桿菌顯著減少(P<0.01);Se-DD98低、高劑量組的大腸桿菌、擬桿菌顯著減少(P<0.01),而梭菌和雙歧桿菌顯著增加(P<0.01)。與伊立替康組比較,Se-DD98低、高劑量組的梭菌、大腸桿菌和擬桿菌相對豐度顯著減少(P<0.01),而雙歧桿菌顯著增加(P<0.01)。Se-DD98低、高劑量組的擬桿菌的減少和雙歧桿菌的增加呈劑量依賴性(圖3)。

圖4 Se-DD98對伊立替康所致腹瀉小鼠回腸組織結構的影響Fig.4 Effect of Se-DD98 on histologic structure of the ileum in diarrhea mice induced by irinotecan注:A：第17 d正常對照組;B:第17 d伊立替康組;C:第17 d Se-DD98低劑量組;D:第17 d Se-DD98高劑量組;E:第24 d正常對照組;F:第24 d伊立替康組;G:第24 d Se-DD98低劑量組;H:第24 d Se-DD98高劑量組。

上述結果表明,伊立替康注射后導致小鼠腸道內與β-D-葡糖醛酸糖苷酶相關的梭菌和擬桿菌相對豐度增加。長期給予Se-DD98菌粉能夠降低小鼠腸道內的梭菌、大腸桿菌和擬桿菌相對豐度,增加長雙歧桿菌相對豐度。由此推知,Se-DD98菌粉能夠緩解伊立替康所致小鼠腹瀉,可能其降低與β-D-葡糖醛酸糖苷酶相關的腸道菌含量并且增加雙歧桿菌含量有關。

2.5 Se-DD98對小鼠回腸組織結構的影響

研究表明,伊立替康導致小鼠嚴重腹瀉,并對腸道結構和細胞有損害作用[31]。第17 d(伊立替康注射前),各組小鼠的小腸腸壁各層結構完好,無潰瘍形成,腺體大小、形態(tài)、分布正常,腸壁未見炎細胞浸潤。第24 d(伊立替康注射后),與正常對照組比較,伊立替康組小腸粘膜變薄、粘膜上皮細胞變性、壞死、脫落,見大量炎細胞浸潤,腺體有萎縮,腸腺減少。與伊立替康組比較,Se-DD98低、高劑量組只顯示部分粘膜上皮細胞變性、壞死、脫落,少量炎細胞浸潤(圖4)。

結果表明,伊立替康會導致小鼠回腸粘膜變薄、粘膜細胞變性以及腺體萎縮等損傷。長期給予Se-DD98菌粉對正常小鼠回腸粘膜、細胞和腺體無影響,但能夠減輕由伊立替康導致的腸道粘膜、細胞和腺體的損傷。由此推知,Se-DD98對正常小鼠腸道結構和細胞無損害作用,但對伊立替康所致的腸道損傷有保護作用;Se-DD98緩解小鼠腹瀉可能與其保護腸道細胞和粘膜有關。

3 結論

本研究結果表明Se-DD98能夠抑制伊立替康所致的小鼠體重下降和免疫功能降低;降低小鼠腹瀉發(fā)生率和平均腹瀉等級,緩解伊立替康所致的小鼠腹瀉。Se-DD98能夠減少腸道內與β-D-葡糖醛酸糖苷酶相關的梭菌、大腸桿菌和擬桿菌含量,并且增加腸道內雙歧桿菌含量,推測Se-DD98可通過調節(jié)腸道菌群緩解伊立替康所致腹瀉。Se-DD98也能夠減輕伊立替康導致的小鼠腸道粘膜、細胞和腺體的損傷,推測Se-DD98緩解腹瀉與保護腸道粘膜有關,具體作用機制有待進一步研究。此外,Se-DD98對正常小鼠免疫功能影響甚微,但能抑制伊立替康所致的機體免疫功能下降,具有調節(jié)機體免疫功能的作用。本研究為應用Se-DD98輔助治療伊立替康等常用化療藥物引起的腹瀉等副作用提供了實驗依據。