過氧化物酶法現(xiàn)場(chǎng)快速鑒定病死雞肉的有效性

劉 娜，高玉斌，陳姿頤，趙建梅，馬 冬，王 娟，曲志娜，王君瑋，趙 格

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266032）

我國(guó)是雞肉生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，而檢疫工作是把好雞肉食用安全的關(guān)口。受利益驅(qū)動(dòng)，私屠濫宰病死或死因不明肉雞的現(xiàn)象仍時(shí)有發(fā)生。而目前尚未建立快速有效鑒定病死或死因不明肉雞及其產(chǎn)品的方法和技術(shù)規(guī)范[1]，這為基層動(dòng)物衛(wèi)生的有效監(jiān)督執(zhí)法帶來挑戰(zhàn)。

過氧化物酶法是目前采用較為廣泛的一種鑒定病死畜禽肉的理化方法[2-4]。過氧化物酶法基本原理是肉浸液中的過氧化物酶催化過氧化氫產(chǎn)生氧氣，進(jìn)而氧化聯(lián)苯胺生成綠色的二酰亞胺代對(duì)苯醌，使健康或新鮮肉迅速顯藍(lán)綠色，而病死或腐敗肉不顯色。前期，本課題組也研究了4種鑒定病死畜禽產(chǎn)品理化方法的有效性和適用性[5]，發(fā)現(xiàn)過氧化物酶法在健康雞肉中并不快速顯色，這與李金梅等的發(fā)現(xiàn)一致[6]，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)此法在病死或死因不明發(fā)生積血的雞肉中反而快速變藍(lán)。這促使本研究進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和時(shí)間點(diǎn)，對(duì)過氧化物酶法鑒定病死或死因不明雞肉進(jìn)行了更詳細(xì)的研究，以期對(duì)病死肉雞及其產(chǎn)品的快速檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

試驗(yàn)中60份病死雞肉來源于山東省某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)當(dāng)天死亡的雞只，120份健康雞肉來自于山東省某肉雞屠宰場(chǎng)屠宰線上的雞只。健康雞肉樣品采集時(shí)，剖開表皮采集雞胸肉；病死雞肉樣品采集時(shí)，同樣剖開表皮，但特別注意采集積血一側(cè)的雞胸肉。樣品采集后，均獨(dú)立放于無(wú)菌塑封袋中，低溫下當(dāng)天送實(shí)驗(yàn)室，分別于室溫、4 ℃冷藏和-20 ℃冷凍保存。

1.2 檢測(cè)時(shí)間

對(duì)不同溫度保存的健康和病死雞肉樣本，分別按表1中的時(shí)間存放后取出檢測(cè)。

表1 樣品不同溫度下的存放時(shí)間 單位：d

1.3 樣品檢測(cè)

自采樣肉品切取片狀肌肉（3 cm×2 cm×0.5 cm）一塊，新鮮切面朝上平置于培養(yǎng)皿中。健康雞肉本色呈白色，而病死積血雞肉本色為紅色。在肉片上滴加0.2%聯(lián)苯胺乙醇溶液5滴、1%過氧化氫溶液2滴，分別記錄變藍(lán)的時(shí)間（即顯色時(shí)間）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過t檢驗(yàn)，分析3種溫度下存放不同時(shí)間的健康雞肉與病死雞肉樣品的顯色時(shí)間是否有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 雞肉顯色

從采集的健康雞肉和病死雞肉的大體照（圖1-A）看，健康雞肉呈粉白色，而病死雞肉出現(xiàn)明顯一側(cè)性血液沉積，局部呈紅色。分別從健康雞肉隨機(jī)割取，從病死雞肉紅色部位割取片狀肉塊，進(jìn)行過氧化物酶顯色反應(yīng)。結(jié)果（圖1-B）顯示：病死雞肉表面和邊緣幾秒內(nèi)迅速出現(xiàn)藍(lán)綠色，而健康雞肉約1 min后沿肉邊緣出現(xiàn)藍(lán)色，肉表面僅有星星點(diǎn)點(diǎn)的不明顯的藍(lán)色。

圖1 過氧化物酶法檢測(cè)雞肉的顯色結(jié)果

2.2 顯色時(shí)間

肉質(zhì)在不同溫度下，經(jīng)過不同時(shí)間的變化也不同，室溫（22～25 ℃）存放3 d即開始腐敗，4 ℃冷藏7 d后開始有腐敗現(xiàn)象發(fā)生，而-20 ℃冷凍60 d后依然肉質(zhì)較正常。利用過氧化物酶法，對(duì)不同溫度下、貯存不同時(shí)間的40份健康雞肉和20份病死雞肉進(jìn)行檢測(cè)，用中位數(shù)（95%置信區(qū)間上、下限）表示顯色時(shí)間。結(jié)果顯示（表2及圖2）：健康雞肉采樣當(dāng)天和室溫存放1 d、2 d的健康雞肉中95%都超過了35 s，2 d后不再出現(xiàn)顯色樣品，3 d時(shí)只有4個(gè)顯色樣品，4 d時(shí)全部出現(xiàn)顯色反應(yīng)；而室溫條件下、不同存放時(shí)間的病死雞肉樣品顯色時(shí)間均集中在5.0～8.0 s。室溫下存放0～5 d的健康雞肉與病死雞肉樣品的顯色時(shí)間差異顯著（P＜0.01）。

冷藏存放不同時(shí)間點(diǎn)的健康雞肉中，95%樣品的過氧化物酶反應(yīng)顯色時(shí)間超過35 s，從存放7 d開始出現(xiàn)不顯色樣品，到15 d時(shí)不顯色樣品達(dá)82.5%（33/40）；而病死雞肉樣品，不同時(shí)間點(diǎn)的顯色時(shí)間主要集中在4.0～8.0 s（表3、圖3）。冷藏條件下，存放1～15 d的健康雞肉與病死雞肉樣品顯色時(shí)間差異顯著（P＜0.01）。

圖2 過氧化物酶法檢測(cè)室溫存放樣品

表2 過氧化物酶法檢測(cè)室溫存放樣品顯色時(shí)間 單位：s

冷凍存放不同時(shí)間點(diǎn)的過氧化物酶法檢測(cè)顯色時(shí)間如圖4及表4所示：95%的健康雞肉樣品的顯色時(shí)間均超過35 s，存放5 d時(shí)出現(xiàn)7個(gè)不顯色樣品，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，不顯色樣品數(shù)量增加并不明顯，60 d時(shí)不顯色樣品為10個(gè)。而病死雞肉樣品在冷凍條件下存放不同時(shí)間的顯色時(shí)間相比室溫和冷藏狀態(tài)有所延長(zhǎng)，多集中在15～22.5 s，直到10 d時(shí)才出現(xiàn)1例不顯色樣品。過氧化物酶法對(duì)冷凍狀態(tài)雞肉檢測(cè)，整體上顯色時(shí)間是推遲的，說明冷凍條件下，雞肉內(nèi)的過氧化物酶多發(fā)生失活現(xiàn)象，但仍保留部分活性。冷凍條件下，存放5～60 d的健康雞肉與病死雞肉樣品顯色時(shí)間差異顯著（P＜0.01）。

表3 過氧化物酶法檢測(cè)冷藏存放樣品顯色時(shí)間 單位：s

圖3 過氧化物酶法檢測(cè)冷藏存放樣品

圖4 過氧化物酶法檢測(cè)冷凍存放樣品

表4 過氧化物酶法檢測(cè)冷凍存放樣品顯色時(shí)間 單位：s

2.3 有效性評(píng)價(jià)

通過比對(duì)過氧化物酶法檢測(cè)健康雞肉和病死雞肉的顯色時(shí)間差異，初步確定30 s為鑒定健康雞肉和病死雞肉的界限。即顯色時(shí)間小于或等于30 s為病死雞肉（陽(yáng)性），大于30 s或者不顯色為健康雞肉（陰性）。另外，上述試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，存放溫度對(duì)過氧化物酶法檢測(cè)結(jié)果的影響較大。因此，接下來根據(jù)30 s的顯色判定時(shí)間，對(duì)不同存放溫度下過氧化物酶法鑒定病死雞肉的有效性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示（表5及圖5）：過氧化物酶法對(duì)室溫和冷藏狀態(tài)雞肉的鑒定非常有效，準(zhǔn)確度均高于95%，敏感性均大于95%，特異性也在95%左右；對(duì)冷凍狀態(tài)雞肉的有效鑒定率也高于80%，但是敏感性略低，特異性尚可。

表5 過氧化物酶法對(duì)病死雞肉鑒定的有效性

圖5 過氧化物酶法對(duì)病死雞肉鑒定的有效性

3 討論

已報(bào)道的檢測(cè)病死畜禽肉的理化方法有多種，如pH法、過氧化物酶法、硫酸銅沉淀法、微生物毒素法等[6-8]，特別是過氧化物酶法，由于其具備現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，備受研究者青睞。近些年推出了數(shù)種基于過氧化物酶法的快速檢測(cè)技術(shù)[9-10]，但均是針對(duì)病死或不新鮮的豬肉，而針對(duì)病死雞肉的深入研究并不多。本實(shí)驗(yàn)室前期研究了上述4種理化方法鑒定病死畜禽產(chǎn)品的有效性[5]，發(fā)現(xiàn)硫酸銅沉淀法可以較有效鑒定病死雞肉，微生物毒素法由于樣品采集時(shí)很難避免環(huán)境微生物等的暴露，檢測(cè)結(jié)果在健康雞肉和病死雞肉間沒有顯著差異，pH試紙法也沒有顯著差異。與常規(guī)思維不同，本研究發(fā)現(xiàn)一些病死雞肉樣品（積血浸潤(rùn)肉）過氧化物酶法的顯色時(shí)間反而早于健康雞肉，這似乎與健康肉品中過氧化物酶含量更豐富相悖。

過氧化物酶是一種廣泛存在于動(dòng)植物等真核生物中的一類氧化酶，催化由過氧化氫參與的氧化反應(yīng)。血紅蛋白和肌紅蛋白是血液和肌肉中運(yùn)輸氧氣的主要大分子，兩者在結(jié)構(gòu)上與辣根過氧化物酶非常類似。已有研究[11-12]表明，血紅蛋白和肌紅蛋白確實(shí)有過氧化物酶活性。正常屠宰的健康雞肉經(jīng)過放血環(huán)節(jié)，雞肉中沒有血液浸潤(rùn)，血紅蛋白含量相對(duì)不高，而病死雞肉在雞發(fā)病至死亡過程中往往發(fā)生一側(cè)性積血，而且積血多出現(xiàn)在靠下的胸腹部，所以采集的病死雞胸肉樣品中基本都有積血浸潤(rùn)現(xiàn)象，即這些病死雞肉樣品中的血紅蛋白比健康雞肉多，因此理論上過氧化物酶法顯色更快、更明顯。

本研究擴(kuò)大了樣本量，進(jìn)一步檢測(cè)了室溫、冷藏和冷凍3種不同溫度下、不同存放時(shí)間的健康雞肉和病死雞肉中過氧化物酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，積血的病死雞肉中過氧化物酶活性確實(shí)較高，不同溫度、不用存放時(shí)間的過氧化物酶顯色時(shí)間普遍較健康雞肉短，且兩者有顯著差異（P＜0.01）。于是選擇30 s的顯色時(shí)間作為過氧化物酶法判定健康雞肉和病死雞肉的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，顯色時(shí)間≤30 s即為病死雞肉陽(yáng)性。隨后，對(duì)此鑒定方法的特異性和敏感性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)對(duì)室溫和冷藏狀態(tài)雞肉的有效鑒定率均高于95%，冷凍狀態(tài)雞肉的有效鑒定率也在80%以上。可見，過氧化物酶法鑒定病死雞肉，快速、敏感、特異，而且不需要特殊儀器設(shè)備，可以作為一種現(xiàn)場(chǎng)快速鑒定病死雞肉的有效方法。