邱冠宇， 李維杰， 劉寶林

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存技術(shù)之一。使用這種技術(shù)可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而保存細(xì)胞特性，這樣在需要的時(shí)候可隨時(shí)復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。同時(shí)適度地保存一定量細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟失，起到了細(xì)胞保種的作用。細(xì)胞的低溫保存有2種方法:慢速冷卻法與玻璃化保存法[1]，這2種方法都需要添加低溫保護(hù)劑[2]。二甲基亞砜(Me2SO，DMSO)是一種重要的滲透型細(xì)胞保護(hù)劑。在超低溫保存細(xì)胞時(shí)使用DMSO冷凍保護(hù)劑，可以有效地防止細(xì)胞內(nèi)液生成冰晶、滲透壓改變、細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂等導(dǎo)致的損傷。DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，通過(guò)降低胞內(nèi)水的冰點(diǎn)來(lái)延緩細(xì)胞的凍存過(guò)程。同時(shí)也能通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)離子濃度, 來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成數(shù)量，從而減少細(xì)胞損傷。DMSO是目前應(yīng)用最為廣泛的細(xì)胞保護(hù)劑之一[3-13]。

目前在細(xì)胞的冷凍保存方面，最常用的DMSO濃度為10%，能夠起到有效的保護(hù)作用，但有研究表明 DMSO 存在嚴(yán)重的毒副作用，它可與細(xì)胞內(nèi)的蛋白巰基基團(tuán)發(fā)生作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，對(duì)肝細(xì)胞膜造成損害[14-15]。有文獻(xiàn)表明, 當(dāng)DMSO≥0.8%時(shí)，隨著濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，DMSO對(duì)RPMI8226 細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈濃度-時(shí)間依賴性關(guān)系(P<0.05)，且在熒光顯微鏡下可觀察到凋亡細(xì)胞[16]。因此，在肝細(xì)胞低溫冷凍保存的過(guò)程中，應(yīng)盡量降低DMSO的濃度，以達(dá)到減少DMSO毒性對(duì)肝細(xì)胞損害的目的。

原發(fā)性肝癌已經(jīng)成為全球常見惡性腫瘤，肝細(xì)胞癌(hepatocellulareareinoma, HCC)是原發(fā)性肝臟惡性腫瘤中的最主要類型，在我國(guó)的發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第4位，死亡率居第3位[17-18]。因此對(duì)肝細(xì)胞研究具有重要的意義。本研究以肝細(xì)胞作為保存對(duì)象，以響應(yīng)面法設(shè)計(jì)不同濃度的DMSO、甘油、海藻糖制成的混合冷凍保護(hù)劑對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存來(lái)探究最佳的配比，以期降低DMSO的濃度，同時(shí)進(jìn)一步提高細(xì)胞的存活率。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料：人肝細(xì)胞(購(gòu)于上海生物細(xì)胞研究所)。

實(shí)驗(yàn)試劑：二甲基亞砜(Me2SO，德國(guó)APPLICHEM公司)；海藻糖、甘油(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)液(GIBCO公司);臺(tái)盼藍(lán)染色液(碧云天生物技術(shù)公司);胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1保護(hù)劑配置 按表1所示進(jìn)行復(fù)合保護(hù)劑的配置。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Design factor and horizontal coding of response surface methodology

1.2.2肝細(xì)胞處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，吹打后將細(xì)胞移至15 mL離心管中(1 000 r·min-1，4 min)。離心結(jié)束后吸棄胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻。將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1.0～1.5 mL。

1.2.3肝細(xì)胞凍存 將裝有細(xì)胞的凍存管放入-4 ℃冰箱2 h，然后放入-80 ℃冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)放置24 h。

1.2.4細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37 ℃溫水中震蕩約2 min。從37 ℃水浴中取出凍存管，將吸出細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中離心(1 000 r·min-1，4 min)。

1.2.5細(xì)胞存活率的計(jì)算 取制成的細(xì)胞懸液，用臺(tái)盼藍(lán)染色的方法[19]測(cè)定肝細(xì)胞存活率。具體方法是：取細(xì)胞液和臺(tái)盼藍(lán)染色劑，以4∶1的比例在小試管中混勻，靜置3 min，取適量用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞與死細(xì)胞數(shù)量來(lái)確定細(xì)胞存活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以確定最佳保護(hù)劑配比。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化冷凍保護(hù)劑配比

根據(jù)表1 選定的響應(yīng)面考察因素和水平，通過(guò)Box-Behnken方法設(shè)計(jì)得到 17 組試驗(yàn)，具體方案及結(jié)果見表2。細(xì)胞復(fù)溫存活率為56.74%～84.35%不等，基本符合預(yù)期，證明3種保護(hù)劑配比設(shè)計(jì)是合適的。其中8組存活率較高，10組存活率較低。

2.2 模型建立與方差分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到肝細(xì)胞存活率(Y)與各因素之間的二次多元回歸擬合方程為：

Y=+80.25+2.78 A-0.66B+8.28C+3.24AB+4.33AC+0.50BC-4.92A2-8.70B2-5.18C2

由表3得知，該二次多項(xiàng)模型顯著，Adeq Precision(精密度)=30.197>4，表明該模型是可用的，足以擬合出試驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)方法較可靠，決定系數(shù)R2=0.992 0，說(shuō)明該回歸方差模型擬合度較好。在該方差分析中，F(xiàn)值體現(xiàn)各單因素對(duì)肝細(xì)胞存活率影響的大小，F(xiàn)值越大，提取效果越好，從表中可以看出C>A>B，即對(duì)肝細(xì)胞存活率的影響因素中，海藻糖的影響最大，其次是DMSO，影響最小的是甘油。

表 2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 The experimental design and results for response surface methodology

2.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面法有著正交試驗(yàn)所不具備的特點(diǎn)，它可以給出直觀的圖形，考察2個(gè)因素之間的交互作用對(duì)肝細(xì)胞存活率的影響[20]。等高線圖為鞍馬或橢圓形時(shí)，表示兩者交互作用較顯著。另外，響應(yīng)面圖中曲面的陡峭程度能直接反映單因素對(duì)該響應(yīng)值存活率影響的大小。

如圖1所示，交互作用DMSO和甘油濃度的等高線呈橢圓形，說(shuō)明兩者交互作用顯著。從響應(yīng)曲面圖可以看出，在A(DMSO濃度)為4%的水平和B(甘油濃度)為6%的水平上，提取效果最好。

如圖2所示，交互作用DMSO和海藻糖濃度的等高線呈橢圓形，說(shuō)明兩者交互作用顯著。從響應(yīng)曲面圖可以看出，在A(DMSO濃度)為4%的水平和C(海藻糖濃度)為0.2%的水平上，提取效果最好。

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析 Table 3 Variance analysis of quadratic respoase surface regression model

注：**表示差異在P<0.01水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

如圖3所示，甘油和海藻糖濃度的等高線呈橢圓形，說(shuō)明兩者交互作用顯著。從響應(yīng)曲面圖可以看出，在B(甘油濃度)為6%的水平和C(海藻糖濃度)為0.2%的水平上，提取效果最好。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)響應(yīng)面試驗(yàn)，最終優(yōu)化出的保護(hù)劑配方參數(shù)為：DMSO濃度3%，甘油濃度6%，海藻糖濃度0.1%。該配比下肝細(xì)胞存活率的預(yù)測(cè)值為84.35%。并在該配比條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到的存活率為81.36%。結(jié)果表明，響應(yīng)面可行性良好，優(yōu)化出的工藝條件有效。

圖1 DMSO和甘油濃度對(duì)肝細(xì)胞復(fù)活率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots of DMSO and glycerol concentrations on hepatocyte reactivation rate

圖2 DMSO和海藻糖濃度對(duì)肝細(xì)胞復(fù)活率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots of DMSO and trehalose concentrations on hepatocyte reactivation rate

圖3 甘油和海藻糖濃度對(duì)肝細(xì)胞復(fù)活率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots of glycerol and trehalose concentrations on hepatocyte reactivation rate

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化冷凍保護(hù)劑中3種試劑濃度的配比，以肝細(xì)胞復(fù)溫存活率為響應(yīng)值進(jìn)行了分析。結(jié)果表明3種因素對(duì)復(fù)溫肝細(xì)胞存活率依次為海藻糖、DMSO、甘油。且得出的最佳工藝參數(shù)為DMSO濃度3%，甘油濃度6%，海藻糖濃度0.1%。在此條件下3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得出的值與預(yù)測(cè)值較為接近，方法較可靠。由此可見，該工藝條件有效地降低了DMSO的濃度，減少了由此帶來(lái)的對(duì)肝細(xì)胞造成的毒性損害，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)提供了細(xì)胞外DMSO的合適濃度，但由于DMSO是一種滲透性保護(hù)劑，至于凍存之后在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了多少DMSO的殘留，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確定；其次，有關(guān)于海藻糖的濃度是否還有細(xì)化的空間也需進(jìn)一步探究。在之前實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，大于0.3%濃度的海藻糖會(huì)由于保護(hù)液的滲透壓太大，從而在凍存前使肝細(xì)胞全部死亡，因此對(duì)海藻糖的濃度有待更深層次的研究。最后，希望通過(guò)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，能夠提示在其他類別的細(xì)胞凍存中也降低DMSO毒性的危害，同時(shí)積極去尋找新型的無(wú)毒保護(hù)劑，來(lái)逐步替代毒性保護(hù)劑。