李 瑩 王 慶 魏 南 曾 悅 崔宗斌 楊宇峰

(1. 暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系, 廣東省高校水體富營養(yǎng)化與赤潮防治重點實驗室, 熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心, 廣州510632; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室, 武漢 430072)

輪蟲是一類體形較小的后生假體腔動物(50—2000 μm), 蛭態(tài)類輪蟲廣泛分布于各水生、半水生(苔蘚、土壤、地衣等)等生境。根據(jù)現(xiàn)被廣泛采用的分類系統(tǒng), 輪蟲動物門包含三個綱: 單巢綱、雙巢綱和尾盤綱[1,2]。蛭態(tài)亞綱輪蟲具有兩個卵巢,終身行孤雌生殖, 在環(huán)境處于缺水或缺氧等惡劣情況時, 脫水可以進入隱生狀態(tài)(Anhydrobiosis), 待環(huán)境好轉(zhuǎn), 重新恢復(fù)到正常的生活狀態(tài)[3]。蛭態(tài)類輪蟲是現(xiàn)今具有基因和形態(tài)特征的最古老且通過無性生殖進化的類群[4,5]。根據(jù)以上蛭態(tài)輪蟲的特征,研究蛭態(tài)輪蟲, 對揭開生物進化、物種分化以及隱生等機制等具有重要的推動作用。

敖突輪屬(Otostephanos)作為宿輪科三屬之一[6],具有宿輪科輪蟲體內(nèi)特有的食物泡(Food pellet), 輪盤伸展時帶有的圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)為該屬輪蟲最重要的分類學(xué)依據(jù)[3,7], 我國僅有該屬記錄一種。環(huán)頸敖突輪蟲(Otostephanos torquatus)在我國蛭態(tài)輪蟲研究中未被報道過, 作為敖突輪屬的常見種, 該輪蟲初始發(fā)現(xiàn)于苔蘚樣品中, 營自由生活, 攝食時, 其形態(tài)發(fā)生改變, 輪盤從頭部伸展出來, 轉(zhuǎn)動輪盤上的纖毛通過濾食方式經(jīng)咀嚼器的作用將食物儲存在內(nèi)腔(Lumen)的食物泡中, 然后以“糞丸”的形式排出體外。

本研究通過對環(huán)頸敖突輪蟲形態(tài)學(xué)特征描述,咀嚼器掃描電鏡圖片和COⅠ序列分析, 對該種的鑒定進行進一步確定。為我國今后蛭態(tài)輪蟲分類和物種鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與活體輪蟲獲取

于2018年4月11日在廣東省珠海市萬山群島(N21°56′15.81", E113°43′5.77")采集苔蘚樣品, 苔蘚著生于石壁上, 常年處于陰暗潮濕的環(huán)境, 該苔蘚植物含水量豐富, 適合蛭態(tài)輪蟲生長繁殖。慢慢將苔蘚撕下, 并放置于牛皮種子袋中, 待室溫自然風(fēng)干后密封保存。

對于附蘚蛭態(tài)輪蟲的提取, 采取震蕩復(fù)蘇法,取少量風(fēng)干后的苔蘚樣品置于50 mL離心管中, 加入約40 mL純水浸泡樣品, 水需沒過苔蘚, 放置0.5h及以上, 劇烈震蕩離心管, 將苔蘚與附著的蛭態(tài)輪蟲分離, 等待蛭態(tài)輪蟲從休眠狀態(tài)復(fù)蘇, 后經(jīng)20 μm篩網(wǎng)過濾, 加純水重復(fù)過濾5—10次, 以便獲取更多的輪蟲, 此方法僅適用于蛭態(tài)輪蟲的定性分析[8,9]。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

使用顯微鏡(OLYMPUS BX51)進行外部形態(tài)學(xué)觀察, 通常狀態(tài)下蛭態(tài)輪蟲處于未攝食狀態(tài), 待蛭態(tài)輪蟲開始攝食后拍攝其頭冠、咀嚼器等重要的分類學(xué)依據(jù), 分類依據(jù)參考《Ordnung Bdelloidea》[10]。拍照后用T Capture軟件測量該輪蟲各部位長度, 測量模型參考Iakovenko等[11]。輪蟲形態(tài)模式圖使用Adobe illustrator CS6 2017軟件繪制。

1.3 咀嚼器掃描電鏡制片

在載玻片上滴加微量甘油, 將方形蓋玻片(邊長0.9 cm)固定于載玻片上, 保證蓋玻片和載玻片表面均干凈無雜質(zhì)。用毛細(xì)玻璃管吸取一只蛭態(tài)輪蟲放在蓋玻片上(吸取的水滴盡可能小), 加入3%次氯酸鈉溶液將輪蟲溶解, 顯微鏡下觀察蟲體的溶解過程, 然后用毛細(xì)管將次氯酸鈉溶液吸出, 加入超純水沖洗5—10次, 直至咀嚼器周圍無雜質(zhì)和結(jié)晶,用馬克筆標(biāo)記咀嚼器的位置, 24h自然風(fēng)干后, 噴金后在掃描電子顯微鏡(ZEISS EVO/MA15)下拍攝觀察該輪蟲咀嚼器形態(tài), 具體咀嚼器制備過程參考De Smet[12]。

1.4 蛭態(tài)輪蟲COⅠ基因克隆及序列分析

挑取環(huán)頸敖突輪蟲若干只置于載玻片上, 用純水清洗至表面無雜質(zhì), 將單個蟲體放入0.2 mL PCR管中, 使用Hotshot方法提取單只蛭態(tài)輪蟲樣品的DNA[13], 向PCR管中加入堿性裂解液10 μL, 95℃裂解0.5h后取出立即放入-20℃冰箱內(nèi)冷凍5min,冷卻后加入中和液10 μL, 即完成蛭態(tài)輪蟲的DNA提取, 隨后進行PCR擴增, 1%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物后測序。引物反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性1min→95℃變性40s→48℃退火40s→62℃延伸45s,循環(huán)5次 →94℃變性40s→ 循環(huán)退火40s→ 循環(huán)延伸45s, 循環(huán)35次, 最后72℃延伸5min→保存[14]。該過程使用引物為(ZplankF1_t1: TGTAAAACGACG GCCAGTTCTASWAATCATAARGATATTGG;ZplankR1_t1: CAGGAAACAGCTATGACTTCAG GRTGRCCRAARAATCA)[15]。測序結(jié)果與NCBI上已有序列進行Blast比對, 尋找親緣關(guān)系相近的物種, 將測序結(jié)果經(jīng)Bioedit軟件處理后, 使用MEGA7.0軟件分析該輪蟲與同科及同屬輪蟲COⅠ序列之間的遺傳距離, 采用鄰接法(Neighbor-Joining method,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖 1 環(huán)頸敖突輪蟲形態(tài)特征Fig. 1 Morphological characteristic of O. torquatus

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)描述

環(huán)頸敖突輪蟲身體縱長(圖 1), 主要分為頭部,軀干和足部三個部分, 無眼點, “卵生”。體內(nèi)器官呈黃棕色, 表皮較光滑, 無附著大顆粒雜質(zhì), 有明顯的縱長條紋。頭部頂端的“吻突”內(nèi)有二分裂半圓形喙片, 長有細(xì)短的纖毛。蟲體最寬處通常位于軀干的后半部, 頸部較長, 背觸手較短, 足部較短, 刺戟近似三角形, 趾3個; 體內(nèi)含有大小不等的食物泡, 卵巢兩個, 軀干兩側(cè)各一個(圖 2)。該輪蟲處于正常活動狀態(tài)時, 輪盤位于頭的內(nèi)部, 不伸展, 趾吸附在附著物上, 依靠縱行肌的收縮前進。在攝食狀態(tài)下, 輪盤從頭部伸出, 左右各一個, 寬度明顯大于頭部, 通過轉(zhuǎn)動其上方的纖毛進行濾食, 食物經(jīng)咀嚼器儲存在內(nèi)腔的食物泡中。食物泡是宿輪科輪蟲特有的結(jié)構(gòu), 食物在食物泡中被消化利用后, 整個食物泡通過泄殖腔以球形糞丸排出體外。頭冠外側(cè)帶有特殊圓環(huán)狀結(jié)構(gòu), 上唇裂片呈三角狀且裂片高度明顯低于輪盤的高度, 此時頭部寬度大于其長度。咀嚼器為蛭態(tài)輪蟲特有的枝型咀嚼器, 齒式為7/7, 還存在若干細(xì)長的肋條狀小齒(圖 3)。

2.2 不同生長狀態(tài)的形態(tài)學(xué)變化

挑取樣品中的環(huán)頸敖突輪蟲進行各部位長度測量(n=10)。結(jié)果如下: 體長(331±41.8) μm, 頭部長度(22.8±1.7) μm, 頭部寬度(27.9±2.6) μm, 頭冠寬度(38.9±2.6) μm, 頸長(54.5±5.9) μm, 足部長(22.7±3.0) μm, 刺戟長(8.4±0.9) μm。通過對比發(fā)現(xiàn), 該輪蟲在生長過程中, 蟲體大小的改變主要取決于軀干部的長度, 頭部和趾的長度在蟲體整個生長過程中無明顯變化。

圖 2 環(huán)頸敖突輪蟲背面觀Fig. 2 Dorsal view of Otostephanos torquatus

圖 3 環(huán)頸敖突輪蟲咀嚼器掃描電鏡照片(ma. 咀嚼器齒式, 比例尺為2 μm)Fig. 3 Trophi of Otostephanos torquatus (ma. major teeth, scale bar=2 μm)

2.3 遺傳距離和進化樹分析

從GenBank中下載與環(huán)頸敖突輪蟲COⅠ基因序列相似度高的物種的COⅠ基因序列, 通過MEGA7.0分析這些物種的遺傳距離。由于Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中無環(huán)頸敖突輪蟲的COⅠ基因序列,我國對同屬的多納敖突輪蟲(Otostephanos donneri)的描述也僅限于形態(tài)特征, 選擇基因庫中同屬的多納敖突輪蟲的COⅠ基因序列聚類分析, 以旋輪科的Pleuretra lineata及盤網(wǎng)輪科的游蕩盤網(wǎng)輪蟲(Adineta vaga)作為環(huán)頸敖突輪蟲的外類群, 宿輪科宿輪屬的Habrotrocha constricta作為同科物種,使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 聚類分析結(jié)果表明該輪蟲的遺傳位置屬于蛭態(tài)亞綱、宿輪科、敖突輪屬(圖 4)。

3 討論

目前蛭態(tài)輪蟲的物種鑒定方法主要依靠形態(tài)學(xué)分類。咀嚼器作為蛭態(tài)輪蟲的重要特征, 為種類鑒定提供了較全面的分類學(xué)依據(jù)[16]。不同蛭態(tài)輪蟲咀嚼器的大小和齒的形式等方面都會存在明顯差異。由于咀嚼器尺寸較小, 采用掃描電鏡可以使咀嚼器的齒式以及細(xì)節(jié)特征更加清晰。在傳統(tǒng)分類學(xué)的基礎(chǔ)上, 通過對蛭態(tài)輪蟲COⅠ基因的提取和序列分析, 為蛭態(tài)輪蟲的物種鑒定提供更加可靠的分子生物學(xué)依據(jù)。

3.1 分類背景

全世界蛭態(tài)亞綱輪蟲目前共記錄4科19屬461種[17], 我國共記錄蛭態(tài)輪蟲3科9屬42種, 敖突輪屬全球共記錄15種, 我國僅記錄1種[18]。對于蛭態(tài)輪蟲的分類學(xué)地位, 我國一般將其歸類于輪蟲動物門、雙巢綱、蛭態(tài)目[19]。根據(jù)最新的分類學(xué)研究,目前國際上將蛭態(tài)輪蟲歸類于蛭態(tài)亞綱[17,20,21]。相對于國外, 我國對蛭態(tài)類輪蟲的分類和物種鑒定尚處于起步階段。

3.2 敖突輪屬特征及其與國內(nèi)外相關(guān)物種的比較

輪盤上帶有的環(huán)狀結(jié)構(gòu)為該屬特有的分類特征, 且該屬輪蟲咀嚼器的齒式, 有助于食物在體內(nèi)形成“食物泡”。咀嚼器的齒式是蛭態(tài)亞綱輪蟲進行物種鑒定的重要分類特征。生活在不同生境的環(huán)頸敖突輪蟲個體間咀嚼器齒的形式存在差異, 在我國分布的該種咀嚼器齒式為7/7, 相較于歐洲, 該種咀嚼器齒式有6/6、7/7、8/8三種形態(tài)[11]。在蛭態(tài)輪蟲的形態(tài)學(xué)物種鑒定的基礎(chǔ)上, 可以結(jié)合分子生物學(xué)的方法對輪蟲進行基因測序, 從基因?qū)用嫔线M一步支持形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。

我國敖突輪屬的記錄僅有一種, 即多納敖突輪蟲(Otostephanos donneriBartos, 1959)[18], 該種發(fā)現(xiàn)在我國云南省, 作者僅把多納敖突輪蟲作為輪蟲群落結(jié)構(gòu)的種類組成記錄, 沒有對其進行具體的形態(tài)學(xué)描述。環(huán)頸敖突輪蟲和多納敖突輪蟲除了體內(nèi)含有食物泡, 輪盤帶有環(huán)狀結(jié)構(gòu)等共有特征外, 蟲體大小長度相近, 上唇形狀也極其相似。但在生活環(huán)境、咀嚼器形態(tài)、刺戟形態(tài)等方面都有明顯差異。通過國外對多納敖突輪蟲的形態(tài)描述, 兩個種的生境和形態(tài)對比如表 1所示。

環(huán)頸敖突輪蟲在韓國和意大利地區(qū)也有記載[4,22],對比該輪蟲在這三個地區(qū)的生存環(huán)境, 此物種均棲息在苔蘚植物水膜中, 迄今, 未在其他環(huán)境中發(fā)現(xiàn)該物種。對比三個區(qū)域該種的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征, 未發(fā)現(xiàn)明顯差異。通過對比我國與意大利和韓國的地理位置, 三個國家的經(jīng)緯度跨度較大, 屬于不同地理板塊, 因此推測該輪蟲在全球分布范圍較廣, 可以適應(yīng)不同的氣候類型和溫度變化。對于某一種蛭態(tài)輪蟲來說, 具有類似細(xì)菌和原生動物的全球分布特征, 這種高擴散能力, 對孤雌生殖的蛭態(tài)輪蟲能夠在地球上長期存在具有重要意義[23,24]。

圖 4 基于環(huán)頸敖突輪蟲COⅠ基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 The Neighbor-joining tree based on CO Ⅰgene sequences of Otostephanos torquatus

表 1 我國新記錄種環(huán)頸敖突輪蟲與已有記錄多納敖突輪蟲的對比Tab. 1 Comparison of the newly recorded species Otostephanos torquatus and the existing record of O. donneri in China

3.3 展望

我國對蛭態(tài)輪蟲的研究基本處于空白, 主要歸結(jié)于三個方面的原因: (1)蛭態(tài)輪蟲生境多樣, 研究者對各種生境蛭態(tài)輪蟲的提取方法不熟悉; (2)缺少蛭態(tài)輪蟲物種鑒定的參考文獻和書籍。目前對蛭態(tài)輪蟲的種類鑒定主要參考德文版的《Ordnung Bdelloidea》[10], 語言限制性大; (3)蛭態(tài)輪蟲無背甲, 易收縮, 活體狀態(tài)下難以獲得其形態(tài)學(xué)信息。隨著科技水平的發(fā)展和研究手段的進步, 通過先進的攝影設(shè)備拍攝蛭態(tài)輪蟲的形態(tài)特征, 使用電鏡、DNA測序等多重手段可擴展蛭態(tài)輪蟲的研究范圍。

我國領(lǐng)土南北緯度跨越近50°, 高原、盆地、平原等地形復(fù)雜多樣, 各地區(qū)蛭態(tài)輪蟲多樣性分布也會有所差異。蛭態(tài)輪蟲在全球從南極到赤道各個緯度區(qū)域均有分布, 可以適應(yīng)多樣的生境變化[25]。我國具有獨特的地理優(yōu)勢, 因此, 加強苔蘚、水體、土壤和地衣等不同棲息地和不同生物地理格局的蛭態(tài)輪蟲分類學(xué)研究非常重要。隨著先進攝影設(shè)備、電鏡技術(shù)和分子測序等多種技術(shù)方法的應(yīng)用, 有望在我國發(fā)現(xiàn)更多的蛭態(tài)輪蟲種類。

近年來, 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展, 國際學(xué)者對蛭態(tài)輪蟲的隱生行為和孤雌生殖領(lǐng)域的分子生物學(xué)研究有重大進展。從基因組層面分析低濕休眠中出現(xiàn)的耐干燥性等分子特征, 得出不同生境的蛭態(tài)輪蟲在基因結(jié)構(gòu)方面存在明顯差異[26]。生態(tài)學(xué)方面, 不同種類的蛭態(tài)輪蟲可以以整體形式作為小型水體營養(yǎng)狀態(tài)的生物指標(biāo)[27]。通過對大樣本蛭態(tài)輪蟲線粒體COⅠ基因的測序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 結(jié)果表明不同的蛭態(tài)輪蟲具有不同的生態(tài)位和棲息地偏好[28]。因此在野外調(diào)查過程中, 調(diào)查不同生境, 獲取更多具有棲息地偏好的物種, 對分子生物學(xué)和生物學(xué)等方面的進一步研究具有重要意義。