丁亞濤 楊 豐 王林林 施文正, 汪之和, ,

(1. 上海海洋大學食品學院, 上海 201306; 2. 國家淡水水產(chǎn)品加工技術研發(fā)分中心(上海), 上海 201306;3. 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心, 上海 201306)

中國漁業(yè)資源豐富, 品種繁多。2017年, 中國全年水產(chǎn)品總產(chǎn)量6.45×1010kg, 同比增長1.03%[1];由此可以看出我國未來幾年水產(chǎn)總量有著持續(xù)穩(wěn)步的增長趨勢。由于中國地域遼闊, 水產(chǎn)養(yǎng)殖量大,為了滿足廣大消費者對不同地區(qū)鮮活水產(chǎn)品的需求, 水產(chǎn)品保活運輸顯得十分重要。

一種有效的高密度魚類運輸方法可有效地減少應激反應和長途運輸中的死亡率, 麻醉是一種有效的保活運輸方法, 它通常能夠降低代謝率[2,3], 提高運輸效率和減緩應激反應[4]。一般常用的麻醉劑包括間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)、丁香油(4-甲-2-甲氧基苯酚)、醇類、氯醛、乙醚、氯酮、巴比妥酸鹽、苯甲卡因和喹啉等。理想的麻醉劑應該具有無毒、廉價、快速誘導等特點[5]。目前, MS-222被美國食品和藥物管理局(FDA)認為是可用的麻醉劑, 但是美國食品藥品管理局要求使用MS-222處理的魚必須經(jīng)過21d的休藥期; 丁香油被FDA認為是安全麻醉劑[6,7], 并對大西洋鮭(Salmo salar)[8]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[9]、鱖(Sini-perca chuatsi)[10]和西伯利亞鱘(Acipenser baerii)[11]幼魚等魚類的麻醉功效進行了研究。

鳊魚又名鳊(Parabramis pekinensis)。在中國,鳊也為團頭魴(武昌魚)和三角魴統(tǒng)稱。鳊是中國養(yǎng)殖量比較大且具有養(yǎng)殖潛力的淡水物種之一, 不僅味道鮮美, 且營養(yǎng)價值較高, 富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。然而, 關于鳊麻醉保活運輸?shù)膱蟮肋€沒有。本研究為探索和確定丁香油在鳊麻醉?；钸\輸中的最佳條件, 并在此條件下進行模擬運輸, 分析魚體指標變化, 為鳊的麻醉?；钸\輸提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗準備

鳊源于中國上海的魚市場, 體重(495.14±28.90) g,體長(20.37±3.06) cm。禁食暫養(yǎng)24h, 溶解氧＞ 6 mg/L。丁香油購買于上海安譜實驗科技股份有限公司; 丁香油與乙醇按比例1∶9溶解, 配成濃度1 g/L備用。

1.2 主要儀器

5B-3N便攜式氨氮測定儀(上海連華科技有限公司)、ZC-10智能型超級恒溫水槽(寧波天恒儀器廠)、UV-1800PC紫外可見分管光度計(上海美譜達儀器有限公司)、JPB-607型便攜式溶解氧測定儀(上海精密科學儀器有限公司)、車載速凍冰箱(佛山艾凱電器有限公司)。

1.3 實驗方法

不同丁香油濃度下鳊呼吸頻率影響的測定將丁香油配制0、5、10、20、30和40 mg/L 6個濃度梯度, 將鳊放入溶液開始計時, 分別記錄鳊在60s、120s、180s、240s、300s和360s時間段內(nèi)的呼吸次數(shù)。呼吸頻率以1min內(nèi)鳊鰓蓋張合次數(shù)來表達(每個平行組樣本為4尾魚)。

不同濃度的丁香油對鳊麻醉效果的研究將鳊分別放入不同濃度丁香油麻醉液之中, 觀察其行為特征和生理反應(每個平行組樣本為4尾魚)。當鳊被麻醉到A6階段后, 立即將其轉移入清水箱中復蘇。確定麻醉和蘇復時間及呼吸頻率。表 1和表 2為鳊麻醉和復蘇效果的標準及行為特征, 在麻醉過程中有6個階段(A1—A6), 恢復過程分為3個階段(R1—R3)。

不同濃度丁香油對鳊?；畲婊盥实挠绊戇x擇呼吸頻率一致的鳊作為試驗對象, 在0、10、20、30和40 mg/L這五個梯度進行試驗, 記錄鳊的存活率(每個平行組樣本為10尾魚, 下同)。

不同水溫對鳊?；畲婊盥实挠绊懺?0 mg/L麻醉劑濃度條件下, 選擇2、7、15和20℃這四個溫度梯度進行試驗, 記錄鳊的存活率。

表 1 麻醉程度分期及魚類行為特征Tab. 1 Anesthesia effects and fish behavior characteristics

表 2 魚體復蘇過程分期及行為特征Tab. 2 Stages and characteristic behavior during fish recovery

不同魚水質(zhì)量比對鳊保活時間的影響在7℃和20 mg/L麻醉劑濃度條件下, 選擇不同魚水質(zhì)量比(2∶1、1∶1、1∶3和1∶5)進行試驗, 記錄鳊?；顣r間。

?；顥l件的優(yōu)化在丁香油麻醉液濃度(0、10、20、30 和40 mg/L)、水溫(2、7、15、20℃)和魚水質(zhì)量比(2∶1、 1∶1、1∶3、 1∶5)單因素試驗基礎上, 確定魚水質(zhì)量比、水溫和麻醉濃度三因素3水平正交試驗來優(yōu)化鳊的存活時間。表 3為正交測試L9(34)參數(shù)。

表 3 L9(34)正交試驗因素及水平表Tab. 3 The table of factors and level in L9(34) orthogonal test levels

鳊保活過程中水體指標的測定在最佳條件下進行?；钤囼? 并測定水體相關指標。在保活過程中的不同時間段, 用離心管分別從?；钕渲腥?5 mL水, 用PB-607A便攜式溶解氧測定儀測定氧含量, 用5B-3N便攜式氨氮測定儀測定氨氮, 用pH計測定pH。

菌落總數(shù)的測定: 在?；钸^程中的不同時間段, 用離心管從?；钕渲腥? mL水, 使用國標GB 4789.2—2016進行測定。

鳊保活過程中魚體指標的測定麻醉組和對照組分別在最佳條件下進行?；钤囼? 在?；钸^程中的不同時間段隨機采樣, 進行指標測定。

肌肉中乳酸和糖元的測定: 采用測試盒測定(購自南京建成生物工程研究所)。

肌肉pH測定方法: 準確稱量2 g魚肉于燒杯中,加0.85%生理鹽水18 mL, 均質(zhì)后靜置0.5h, 使用pH計測定。

血清生化指標的測定: 從魚尾靜脈采血, 血清中谷草轉氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)、尿素(UARBAMIDE)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酐(CREA)采用試劑盒測定, 購自南京建成生物工程研究所。

數(shù)據(jù)處理使用Microsoft Excel 2007和SPSS19.0軟件進行分析, 在單因素方差分析的基礎上采用Duncan (D)多重比較法, 統(tǒng)計值為平均值±標準差, 顯著性水平為P＜0.05; 利用Origin 8.0軟件繪制相關圖表。

2 結果

2.1 在不同丁香油濃度中鳊呼吸頻率的變化

呼吸頻率是反映鳊麻醉程度的重要指標之一。表 4中顯示不同濃度丁香油麻醉液中鳊呼吸頻率(鰓蓋運動)的變化。隨著丁香油濃度的增加, 呼吸頻率逐漸下降。在0和5 mg/L濃度時, 鳊呼吸頻率沒有顯著變化。在10 mg/L濃度下, 呼吸頻率有所減少, 但二者均無應激反應, 在20和30 mg/L時,呼吸頻率顯著下降, 在40 mg/L時, 呼吸率在短時間內(nèi)急劇下降, 出現(xiàn)鰓蓋運動停止的現(xiàn)象。

2.2 不同麻醉濃度下鳊麻醉、復蘇過程的行為特征及麻醉后復蘇率

在不同濃度的丁香油麻醉溶液中, 鳊表現(xiàn)出一系列不同的行為特征(表 5和表 6)。麻醉和復蘇時間隨著丁香油濃度的不同而變化。隨著丁香油濃度的增加, 鳊進入麻醉的時間縮短, 復蘇時間也相應增加。丁香油濃度為0, 鳊沒有被麻醉。在5 mg/L的濃度下, 鳊最終達到了A1階段。在濃度增加到10 mg/L時, 魚的麻醉程度加深, 最終將停留在A2階段。在20 mg/L的濃度下, 需要較長時間達到A6, 復蘇時間增加, 在清水中可以恢復到正常狀態(tài)。當麻醉溶液濃度為30和40 mg/L時, 大多數(shù)魚都達到了A6, 魚體蘇醒需要很長時間, 復蘇后活力較差, 復蘇率也有下降。

2.3 不同麻醉劑濃度對鳊存活率的影響

如圖 1所示, 在濃度為0和10 mg/L時, ?；?6h后存活率顯著下降。麻醉濃度為20 mg/L, ?；?8h內(nèi)的存活率仍為90%; 麻醉濃度為30 mg/L, 存活率在24h后顯著降低, 保活48h存活率下降至20%。當麻醉濃度40 mg/L, 12h后存活率顯著下降,并且保活36h存活率降為0。由此可見, 麻醉濃度為20 mg/L?；顣r存活率較高。

2.4 不同溫度對鳊存活率的影響

如圖 2所示, 在水溫20℃時的鳊的存活率顯著下降, 在24h內(nèi)下降到30%, 并且48h后存活率為0。在15℃時, 24h之后顯著下降, 48h的存活率下降到30%。在7℃時, 36h后出現(xiàn)死亡, 48h的存活率為80%。然而在2℃時, 12h存活率下降到50%,24h存活率為0。由此可見, 在7℃?；顣r存活率較高。

表 4 鳊在不同濃度中各個時間段呼吸頻率的變化Tab. 4 Breath frequency of bream at different times under of anesthesia of different concentrations

表 5 不同濃度丁香油對鳊麻醉影響Tab. 5 The effect of different concentrations of clove oil on the anesthetic level in bream

2.5 不同魚水質(zhì)量比對鳊?；顣r間的影響

如圖 3所示, 當魚水質(zhì)量比從2∶1增加到1∶3時,存活時間顯著增加, 且1∶1到1∶3保活時間增加了28h, 增幅較大。從1∶3到1∶5的增長并不顯著, 所以魚水質(zhì)量比1:3比較適宜。

2.6 正交試驗優(yōu)化結果

單因素試驗結果表明, 當丁香油濃度為20 mg/L時, 鳊存活率較高, 因此, 在正交試驗中選擇丁香油濃度為15、20和25 mg/L。水溫在7℃和15℃時,鳊存活率較高, 所以, 在正交試驗中選擇了水溫是5℃、9℃和13℃。魚水質(zhì)量比從1∶1增加到1∶3, 鳊存活時間增幅最大, 即正交試驗中魚水質(zhì)量比選擇1∶1、1∶2和1∶3。由表 3正交試驗因素及水平進行試驗, 得出正交試驗結果見表 7。

表 6 鳊在不同丁香油濃度后的復蘇情況Tab. 6 The effect of different concentrations of clove oil on the degree of the degree of bream

圖 1 不同濃度丁香油對鳊?；畹拇婊盥视绊慒ig. 1 The variation in the survival rate of bream soaked in different concentrations of clove oil solution

正交試驗結果顯示(表 8), 影響鳊?；畹囊蛩貫? A(魚水質(zhì)量比)＞B(水溫)＞C(麻醉濃度), 麻醉保活最佳條件為A3B2C1, 即魚水質(zhì)量比為1∶3, 水溫為9℃, 麻醉濃度為15 mg/L。

驗證試驗顯示, 在此條件下, 鳊50h內(nèi)存活率100%, 當保活64h, 存活率80%以上。而對照實驗?；?4h, 存活率僅為53.3%。

圖 2 不同水溫對鳊存活率的影響Fig. 2 Effect of different temperatures on the survival rate of bream

圖 3 魚水質(zhì)量比對鳊?；顣r間的影響Fig. 3 The effect of the fish water quality ratio on the survival time of bream

2.7 鳊?；钸^程中水體指標的變化

如表 9所示, 在魚水質(zhì)量比為1∶3, 水溫為9℃,麻醉濃度為15 mg/L條件下, 鳊?；钸\輸過程中水質(zhì)指標的變化。結果顯示, 對照組和麻醉組水體pH在7.4—7.9; 溶解氧的含量在6.3—6.6 mg/L波動,無明顯變化; 水中氨氮的含量顯著上升, 麻醉組?；?8h氨氮濃度上升至4.03 mg/L, 但明顯低于對照組。菌落總數(shù)也有顯著增加, 麻醉組略低于對照組。氨氮濃度和微生物這二項指標的增加可能是導致魚體死亡的主要原因。

2.8 鳊?；钸^程中魚體相關成分的變化

肌肉相關成分的變化如圖 4所示, 在魚水質(zhì)量比為1∶3, 水溫為9℃, 麻醉濃度為15 mg/L條件下, 鳊?；钸\輸過程中魚體肌肉指標的變化。結果表明, 在保活過程中, 鳊肌肉中糖元、乳酸和pH都發(fā)生了一定程度的變化, 糖元含量明顯下降, 麻醉組?；?8h后下降了35.5%, 下降趨勢低于對照組。麻醉組乳酸含量在24h內(nèi)顯著增加, 增加趨勢低于對照組, 然后略有下降。麻醉組和對照組pH均先降后升, 這與鳊在麻醉?；钪屑√窃漠a(chǎn)生乳酸導致pH變化有關。

血清生化指標的變化如表 10所示, 在魚水質(zhì)量比為1∶3, 水溫為9℃, 麻醉濃度為15 mg/L條件下, 鳊?；钸\輸過程中魚體血清生化指標的變化。結果表明, 麻醉組谷草轉氨酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)活性在12h后顯著增加, 48h后AST和LDH的活性比初始值分別增加了4.3倍和1.9倍。血糖(GLU)含量逐漸增加。尿素和肌酐含量隨保活時間的增加而上升, 48h后分別增加了2.9倍和3.5倍, 以上指標的變化均為麻醉組低于對照組。

表 7 正交試驗結果Tab. 7 Results of the L9(34) orthogonal test

表 8 正交試驗結果方差分析Tab. 8 Analysis of variance

3 討論

3.1 丁香油濃度、水溫和魚水質(zhì)量比對鳊存活率的影響

麻醉可以減少魚類運輸過程中的一般活動和應激反應。研究結果表明, 丁香油濃度對鳊?；钸\輸?shù)某苫盥视忻黠@影響。隨著丁香油濃度的增加,鳊的呼吸頻率逐漸下降, 在丁香油濃度為20 mg/L時, 鳊的存活率最高。丁香油濃度40 mg/L時, 由于濃度過高, 會對鳊產(chǎn)生毒害而無法復蘇, 降低了其存活率。而濃度為0和10 mg/L時, 由于濃度過低達不到麻醉鳊的效果, 對其存活率的提高作用較小。溫度是影響魚類生理狀況的重要因素之一, 魚類為變溫動物, 其生理狀況受環(huán)境溫度的影響較大, 隨著溫度的升高, 魚的代謝率增加, 耗氧量增加。但在過低溫度下, 魚體本身需要提供能量來應對外界低溫, 呼吸頻率下降, 無法滿足魚體用氧而導致其死亡, 鳊在在水溫7℃左右運輸存活率較高。在水產(chǎn)品?；钸\輸中降低魚水質(zhì)量比是需要考慮的重點之一; 綜合考慮?；顣r間和成活率等因素, 選擇魚水質(zhì)量比1∶3符合最大的經(jīng)濟效益。

表 9 ?；钸^程中水質(zhì)指標變化Tab. 9 Changes in water quality parameters during the test

3.2 ?；钸^程中水體指標變化對鳊存活率的影響

魚類氨氮耐受水平一般在2.0 mg/L左右, 試驗結果顯示, 隨著?；顣r間的延長, 氨氮濃度逐漸增加, ?；?8h后對照組氨氮濃度是麻醉組的1.9倍, 說明麻醉能降低魚體代謝產(chǎn)生氨氮, 減緩水質(zhì)惡化, 更利于鳊的存活; 但麻醉組氨氮濃度也超出魚類氨氮耐受水平, 這也是鳊?；?8h后存活率下降的重要原因之一。這與Park等[4,12]研究尖吻鱸模擬麻醉運輸和王利娟等[13]研究加州鱸?；畹慕Y果有類似的趨勢一致。溶解氧對魚類等水生生物的生存至關重要。當溶解氧低于5 mg/L時, 大多數(shù)魚很難存活[14], 在試驗過程中溶氧量范圍在6.3—6.6 mg/L, 高于此推薦值。Rodrigues等[15]認為, 對于軍曹魚(Rachycentron canadum)來說pH安全值最低是6.5, 本試驗中pH從6.9增加到7.8, 此結果在淡水魚水質(zhì)標準的pH 6.6—8.5[16]。菌落總數(shù)是評估水污染程度的重要指標[17]。在漁業(yè)水質(zhì)標準中[16], 大腸桿菌的總數(shù)必須低于每5000個/L。隨著水中細菌總數(shù)的增加, 氧氣的消耗將會增加, 代謝廢物增多, 從而導致水的渾濁度增加; 在鳊?；?8h后, 細菌數(shù)增加, 水質(zhì)發(fā)黃、渾濁, 這也是影響鳊存活時間原因之一。

圖 4 ?；钸^程肌肉中乳酸、糖元、pH的變化Fig. 4 Changes in lactic acid, glycogen, and pH in muscle during the experimental process

表 10 鳊?；钸^程中血清生化指標變化Tab. 10 Changes in the serum biochemical values in bream after transportation under anesthesia

3.3 麻醉?；顚∪庀嚓P成分和血清生化指標的影響

糖元、葡萄糖和乳酸水平在肌肉、血液和肝臟中保持一定的平衡, 魚類利用肝糖元的能力差,主要分解肌糖元[18]。鳊在保活中肌糖元含量顯著減少, 可能是因為魚處于饑餓狀態(tài), 血液中葡萄糖無法滿足魚體的需要, 而肌肉糖元就會被分解, 這與王利娟等[19]研究加州鱸魚模擬?；畹慕Y果類似。乳酸含量先升后降, 這與糖元分解產(chǎn)生乳酸有關, 并導致肌肉pH下降, 隨著乳酸的分解, pH又上升。LDH是一種與葡萄糖代謝有關的酶, 當器官和組織受損時, LDH釋放進入血液, 使血清LDH水平上升。AST是肝臟中連接糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝的一個重要酶, 當組織受損時會升高, 并且它能在谷氨酸和草酰乙酸之間起到催化轉氨作用。在鳊保活中, 麻醉組血清LDH和AST在12h后顯著增加,表明隨著?；顣r間的延長, 對肝功能有一定程度的影響。血漿葡萄糖升高被認為是魚類應激反應指標之一, 當細胞代謝功能失調(diào), 葡萄糖利用率低時會導致血糖水平升高。在鳊?；钤囼炛? 麻醉組血糖濃度在36h內(nèi)增加了2.6倍, 之后血糖降低, 說明隨著保活時間的延長, 魚體會產(chǎn)生應激反應, 但魚體通過自身的調(diào)節(jié)逐漸適應環(huán)境。尿素和肌酐含量的變化可以反映腎臟功能的代謝狀況, 尿素也是維持血液滲透壓的主要成分。在腎功能不全的情況下, 血液尿素和肌酐會增加。本實驗結果顯示, 麻醉組鳊血液尿素和肌酐含量逐步上升, 保活48h時分別增加了2.9倍和3.5倍, 說明在整個?；钸^程中腎功能受到一定程度的影響。綜合以上指標可見,丁香油在用于鳊麻醉?；钸\輸時, 有助于延長其保活時間和提高成活率。