李子義 賀子航 盧惠君 王玉成 及曉宇

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室,哈爾濱 150040)

土壤鹽漬化嚴重限制了植物正常生長，是全球農(nóng)林業(yè)發(fā)展的一個重要問題。植物通過信號傳導(dǎo)途徑調(diào)控基因表達來響應(yīng)鹽脅迫[1]，隨著分子開關(guān)控制應(yīng)激反應(yīng)基因的表達，轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)各種非生物脅迫應(yīng)激反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。因此，研究轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的基因表達網(wǎng)絡(luò)并篩選出抗逆能力優(yōu)良的基因，進而培育良種，具有重要的生態(tài)、社會意義[2]。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物第二大類轉(zhuǎn)錄因子家族[3]，包含N端堿性區(qū)域和C端螺旋—環(huán)—螺旋區(qū)域兩個結(jié)構(gòu)域[4～5]，其主要通過參與復(fù)雜的信號通路來調(diào)控下游基因的表達[6]，進而調(diào)節(jié)植物各種生理生化反應(yīng)及生長發(fā)育過程[7]。到目前為止，研究者在水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)和小麥(Triticumaestivum)基因組中共鑒定出183，231和571種bHLH轉(zhuǎn)錄因子，與擬南芥(Arabidopsisthaliana)的1 154個bHLH轉(zhuǎn)錄因子被分為36個亞科[8]。已有部分植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能被鑒定出來，如煙草(Nicotianatabacum)NtbHLH123、小麥TabHLH1及擬南芥AtbHLH18，AtbHLH34和AtbHLH115等[9～13]，而在擬南芥中還有許多bHLH轉(zhuǎn)錄因子功能亟待鑒定。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員在植物生長發(fā)育、生理代謝中起重要作用[6]。例如，在煙草中，NtbHLH93主要在生育期側(cè)根和盛花期子房組織中高表達[14]。在番茄(Solanumlycopersicum)中，SlbHLH22誘導(dǎo)表達細胞壁代謝相關(guān)基因(SlEXP1，SlLoxA，SlMAN，SlPE和SlXTH5)，過表達SlbHLH22番茄果實較野生型成熟快[3]。PREs(Paclobutrazol Resistances)參與調(diào)節(jié)植物對赤霉素、油菜素類固醇和生長素(IAA)等幾種不同植物激素的反應(yīng)[15]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子MYC2是茉莉酸(JA)信號通路的重要調(diào)節(jié)因子，在蘋果(Malusdomestica)中花青素生物合成基因MdDFR，MdUF3GT，MdF3H和MdCHS的轉(zhuǎn)錄水平在過表達MdMYC2愈傷組織中顯著上調(diào),使過表達的愈傷組織產(chǎn)生更多的花青素[16]。

不僅如此，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫響應(yīng)過程中也起到重要作用[17]。許多研究表明過表達bHLH基因增強了植物對鹽、干旱、冷凍及氧化脅迫的耐受性[4,18～20]。過表達AtbHLH104擬南芥增強了其鎘(Cd)脅迫耐受性[21]，bHLH104轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)節(jié)四種重金屬解毒相關(guān)基因(IREG2，MTP3，HMA3和NAS4)，這些基因在Cd螯合和耐受中起作用。在煙草中過表達穇子(Eleusinecoracana)EcbHLH57基因顯著提高了其對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性。過表達EcbHLH57煙草在干旱脅迫下，表現(xiàn)出較高的光合速率和氣孔導(dǎo)度；在鹽脅迫下，積累較高的種子重量和莢果數(shù)，從而提高了煙草的耐鹽抗旱功能[22]。在水稻中，鹽脅迫下過表達OsbHLH068降低了水稻H2O2的積累，促進了根系的伸長，保持水分來抵抗脅迫[23]；OsbHLH062介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控鹽脅迫耐受相關(guān)基因的表達，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，增強水稻的耐鹽能力[24]。上述研究表明bHLH轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)非生物脅迫的過程中起關(guān)鍵作用。

擬南芥bHLH蛋白Ⅺ亞家族共有五個成員，包括bHLH7(AT1G03040)、bHLH82(AT5G58010)、bHLH69(AT4G30980)、bHLH59(AT4G02590)及bHLH66(AT2G24260)[25]，本研究中AtUNE12基因(AT4G02590)屬于該亞家族。據(jù)已有研究，發(fā)現(xiàn)bHLH蛋白Ⅺ亞家族中bHLH69基因[26]與bHLH82基因[27]響應(yīng)非生物脅迫，我們推測該亞家族其他基因也可能具有抗逆功能，因此，本研究擬對AtUNE12基因的耐鹽功能進行鑒定，以期為進一步探究bHLH轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)非生物脅迫的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

哥倫比亞野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)：生態(tài)型Columbia(Col-0)其種子由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室保存。

將擬南芥種子播種于蛭石、珍珠巖及黑土(體積比為3∶1∶1)的混合土中，置于溫度為22±2℃，相對濕度為65%～75%，光照強度為400 μmol·m-2·s-1，光周期為16 h光照/8 h黑暗的人工培養(yǎng)室培養(yǎng)。

1.2 質(zhì)粒與菌株

植物表達載體pROKⅡ、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α及根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105均由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點實驗室保存。

1.3 擬南芥總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成

選取4周苗齡的擬南芥植株，利用TRIzol法[28]，進行總RNA的提取。參照PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒說明合成cDNA第一鏈以備用。

1.4 AtUNE12基因的克隆

根據(jù)AtUNE12基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計克隆引物AtUNE12-F和AtUNE12-R(表1)，以合成的擬南芥cDNA為模板，進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增，將獲得的克隆片段與pMD18-T(TaKaRa)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后測序鑒定。

1.5 多序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)網(wǎng)站進行BlastP檢索，獲得與擬南芥AtUNE12基因同源性較高的12個不同物種的bHLH氨基酸序列，利用BioEdit軟件進行多序列比對，并利用MEGA6.0軟件，使用鄰位歸并法(Neighbor-joining)進行系統(tǒng)進化樹分析。

1.6 AtUNE12基因植物過表達載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物pROKⅡ-AtUNE12-F和pROKⅡ-AtUNE12-R(表1)，引入SmaⅠ酶切位點，用SmaⅠ(NEB)線性化pROKⅡ載體質(zhì)粒，將克隆獲得的AtUNE12基因與線性化pROKⅡ載體進行同源融合(Infusion)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測序驗證，結(jié)果與原序列比對正確之后提取重組pROKⅡ-AtUNE12載體質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌中，利用浸花法[29]獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥。對轉(zhuǎn)基因擬南芥進行DNA提取[30]，用pROKⅡ載體引物進行PCR，電泳檢驗，并通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)進行檢測，利用2-ΔΔCt法進行基因的相對表達量分析[31]，最終獲得T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥。

表1 引物序列

1.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長、鮮重測定分析

將過表達AtUNE12擬南芥T3代純合株系與對照擬南芥種子平鋪于1/2 MS培養(yǎng)基上，待種子萌發(fā)5 d后，分別轉(zhuǎn)移至1/2 MS和含有150 mmol·L-1NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基平板上，在人工培養(yǎng)室直立培養(yǎng)7 d后觀察各植株的長勢，測定其根長及鮮重并拍照，數(shù)據(jù)使用SPSS18.0進行統(tǒng)計分析。

1.8 擬南芥耐鹽生理生化指標測定

將4周苗齡的過表達AtUNE12擬南芥T3代純合株系與對照擬南芥植株的土培苗用150 mmol·L-1NaCl溶液進行脅迫處理，分別取脅迫處理的過表達AtUNE12與對照擬南芥植株(3次生物學(xué)重復(fù))，測定植株的過氧化物酶(POD)與超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫(H2O2)含量、電解質(zhì)滲透率、丙二醛(MDA)含量及失水率(失水率分別在脅迫0.5、1、2、3、4及5 h進行測定)，方法參照植物基因工程實驗技術(shù)指南[32]，數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtUNE12基因多序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

AtUNE12基因的開放閱讀框為933 bp，編碼310個氨基酸。在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)網(wǎng)站上對其編碼的氨基酸序列進行同源搜索BLAST，發(fā)現(xiàn)AtUNE12與棗ZjbHLH和番木瓜CpbHLH的相似性高達99%。通過多序列比對及系統(tǒng)進化樹分析其氨基酸序列與其他12個物種的bHLH蛋白的相似性，多序列比對結(jié)果顯示，AtUNE12具有bHLH家族典型的序列特征(圖1A)。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，AtUNE12與EsbHLH蛋白的親緣關(guān)系較近，推測二者可能具有相似的功能(圖1B)。

2.2 AtUNE12基因的克隆及pROKⅡ-AtUNE12載體驗證

以合成的擬南芥cDNA為模板，用克隆引物AtUNE12-F和AtUNE12-R進行PCR，克隆獲得AtUNE12基因(圖2A)。將AtUNE12基因與pROKⅡ載體連接后，利用pROKⅡ載體引物pROKⅡ-F和pROKⅡ-R(表1)進行PCR檢查，電泳結(jié)果顯示AtUNE12基因已成功構(gòu)建到pROKⅡ載體中(圖2B)。

2.3 轉(zhuǎn)AtUNE12基因擬南芥的檢測

提取T3代9個株系轉(zhuǎn)AtUNE12基因擬南芥的DNA[30]，用AtUNE12基因克隆引物進行PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3A)；對過表達AtUNE12擬南芥植株進行RNA提取，利用qRT-PCR技術(shù)檢測9個株系中AtUNE12的相對表達量，結(jié)果表明AtUNE12基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥(圖3A)，并且OE3與OE7株系中AtUNE12基因的表達量較其他株系高(圖3B)。因此，選擇OE3和OE7過表達株系進行后續(xù)的耐鹽功能分析。

圖1 AtUNE12多序列比對及系統(tǒng)進化樹分析 A.多序列比對黑框表示bHLH家族的2個保守結(jié)構(gòu)域；B.系統(tǒng)進化樹百分數(shù)表示自展值 EsbHLH.山萮菜(XP_006396471.1)；CrbHLH.薺菜(XP_023637045.1)；CsbHLH.亞麻薺(XP_010456011.1)；ThbHLH.醉蝶花(XP_010556765.1)；CpbHLH.番木瓜(XP_021898025.1)；ZjbHLH.棗(XP_015891470.1)；TcbHLH.可可樹(XP_017983588.1)；RcbHLH.蓖麻(XP_002520976.1)；GmbHLH.大豆(XP_003554277.1)；SsbHLH.密花豆(TKY62402.1)；QsbHLH.歐洲栓皮櫟(XP_023886707.1)；CcbHLH.木豆(XP_020227636.1)Fig.1 Multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis of AtUNE12 A.Multiple sequence alignment black boxes indicate two conserved domains of the bHLH family；B.Phylogenetic tree percentage indicate bootstrap values EsbHLH.Eutrema salsugineum；CrbHLH.Capsella rubella；CsbHLH.Camelina sativa；ThbHLH.Tarenaya hassleriana；CpbHLH.Carica papaya；ZjbHLH.Ziziphus jujuba；TcbHLH.Theobroma cacao；RcbHLH.Ricinus communis；GmbHLH.Glycine max；SsbHLH.Spatholobus suberectus；QsbHLH.Quercus suber；CcbHLH.Cajanus cajan

圖2 AtUNE12基因克隆及pROKⅡ-AtUNE12載體驗證結(jié)果 A.基因克隆驗證；B.載體構(gòu)建驗證；M.DL2000 MarkerFig.2 The results of AtUNE12 gene cloning and pROKII-AtUNE12 vector verification A.Verification of gene cloning; B.Verification of vector construction; M.DL2000 Marker

2.4 過表達AtUNE12基因與野生型擬南芥的根長、鮮重測定結(jié)果

在鹽脅迫下，觀察過表達AtUNE12與野生型擬南芥植株長勢，統(tǒng)計根長及鮮重數(shù)據(jù)，拍照。結(jié)果表明：鹽脅迫下，過表達株系(OE3和OE7)的根長及鮮重顯著高于野生型(Col-0)植株(圖4)，說明過表達AtUNE12基因顯著提高了擬南芥植株的耐鹽能力。

2.5 過表達AtUNE12基因與野生型擬南芥植株的MDA含量、電解質(zhì)滲透率及失水率分析

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接說明膜系統(tǒng)受損程度及植物的抗逆性。分別取鹽脅迫處理的過表達AtUNE12基因與對照擬南芥植株葉片進行MDA含量測定(3次重復(fù))。結(jié)果表明：在正常生長條件下，過表達AtUNE12基因(OE3和OE7)及野生型(Col-0)擬南芥植株的MDA含量無明顯差異；而在鹽脅迫條件下，過表達AtUNE12基因擬南芥的MDA含量明顯低于野生型擬南芥(圖5A)。

電解質(zhì)滲透率是反應(yīng)細胞膜受損情況與程度的重要生理指標之一，電解質(zhì)外滲越多，說明植物受損傷越嚴重。分別取鹽脅迫處理的過表達AtUNE12基因與對照擬南芥植株葉片進行電解質(zhì)滲透率測定(3次重復(fù))。結(jié)果表明：在正常生長條件下，過表達AtUNE12基因及野生型擬南芥植株電解質(zhì)滲透率無明顯差異；而在鹽脅迫條件下，過表達AtUNE12基因擬南芥的電解質(zhì)滲透率明顯低于野生型擬南芥(圖5B)。

植物離體葉片失水率是研究植物抗逆的重要生理指標之一，一般情況下，植物的抗逆性與離體葉片失水狀況成負相關(guān)。分別取過表達AtUNE12基因與對照擬南芥植株葉片進行失水率測定(3次重復(fù))，結(jié)果表明：過表達AtUNE12基因及野生型擬南芥植株0.5 h內(nèi)失水率沒有明顯的變化；1～5 h內(nèi)，過表達AtUNE12基因及野生型擬南芥植株的失水率差距逐漸增大，其中OE3的失水率最低(圖5C)。上述結(jié)果說明過表達AtUNE12基因顯著降低了鹽脅迫下擬南芥的電解質(zhì)滲透率，MDA含量及失水率，保護細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，從而增加擬南芥的耐鹽能力。

圖3 T3代過表達AtUNE12擬南芥的檢測結(jié)果 M.DL2000 Marker; OE1～OE9.T3代AtUNE12基因過表達株系1～9；+.陽性對照；-.陰性對照Fig.3 Identification of Arabidopsis thaliana with overexpression of AtUNE12 M.DL2000 Marker; OE1-OE9.Overexpression AtUNE12 gene of T3 generation strain 1-9; +.Positive control; -.Negative control

圖4 鹽脅迫下過表達AtUNE12及野生型擬南芥的長勢分析Fig.4 Growth analysis of OE and Col-0 A.thaliana under salt stress

圖5 鹽脅迫下過表達AtUNE12及野生型擬南芥MDA含量、電解質(zhì)滲透率及失水率分析Fig.5 MDA contents,Electrolyte leakage and water loss rates in OE and Col-0 A.thaliana under salt stress

2.6 過表達AtUNE12基因與野生型擬南芥植株P(guān)OD、SOD活性及H2O2含量測定

POD與SOD能清除植物在脅迫過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，探究POD與SOD活性以反映植物抗逆能力。分別取鹽脅迫后的過表達AtUNE12基因及對照擬南芥植株進行POD與SOD活性測定(3次重復(fù))。結(jié)果表明：正常生長條件下，過表達AtUNE12基因(OE3和OE7)及野生型(Col-0)擬南芥POD、SOD活性無明顯差異；而鹽脅迫下，過表達AtUNE12基因擬南芥的POD、SOD活性要顯著高于野生型擬南芥(圖6:A，B)。上述結(jié)果表明AtUNE12基因在擬南芥中正向調(diào)控POD和SOD活性，增強了擬南芥的ROS清除能力，進而提高了擬南芥的耐鹽功能。

測定過表達AtUNE12基因與對照擬南芥植株內(nèi)的H2O2含量變化，以分析其活性氧(ROS)水平。分別取鹽脅迫過表達AtUNE12基因及對照擬南芥葉片測定H2O2含量(3次重復(fù))，結(jié)果表明：在正常生長條件下，H2O2含量在過表達AtUNE12基因(OE3和OE7)及野生型(Col-0)擬南芥中基本一致；而在鹽脅迫下，過表達AtUNE12基因擬南芥的H2O2含量明顯低于野生型擬南芥(圖6C)。上述結(jié)果表明過表達AtUNE12基因能夠降低擬南芥植株內(nèi)H2O2的含量，進而降低ROS的積累。

圖6 鹽脅迫下過表達AtUNE12及野生型擬南芥植株ROS水平及POD、SOD活性分析Fig.6 Analysis of ROS accumulation and the activities of POD and SOD in OE,Col-0 A.thaliana under salt stress

3 討論

本研究選取擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的AtUNE12基因進行耐鹽功能分析。通過浸花法獲得了AtUNE12基因過表達擬南芥，利用qRT-PCR技術(shù)選出AtUNE12基因相對表達量較高的OE3和OE7株系，用于后續(xù)耐鹽能力的分析。分別對AtUNE12基因過表達及野生型擬南芥植株的根長、鮮重及耐鹽生理指標進行測定。在鹽脅迫下，發(fā)現(xiàn)過表達AtUNE12基因擬南芥的根長、鮮重及長勢顯著優(yōu)于野生型，為了進一步驗證AtUNE12基因的耐鹽功能，在鹽脅迫下，AtUNE12基因的過表達降低擬南芥植株的電解質(zhì)滲透率、MDA含量及失水率，減輕細胞損傷，進而增加擬南芥的耐鹽能力。通過POD和SOD活性及H2O2含量測定，來檢驗擬南芥體內(nèi)的ROS水平。在鹽脅迫下，過表達AtUNE12植株的POD、SOD活性要顯著高于野生型植株，H2O2含量明顯低于野生型。因此，我們推斷在鹽脅迫下，AtUNE12基因的過表達能夠影響相關(guān)調(diào)控POD、SOD酶活的基因，進而提高了擬南芥ROS清除能力。

大量的研究表明bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因能提高植物對非生物脅迫的耐受性。過表達剛毛檉柳(Tamarixhispida)ThbHLH1基因通過增強ROS清除能力，提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥及剛毛檉柳的耐鹽和抗旱能力[33]。將AtUNE12基因進行blast比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與ThbHLH1基因具有較高的同源性。NtbHLH123基因在煙草中過量表達，參與脅迫相關(guān)基因的表達調(diào)控，能夠正向調(diào)節(jié)煙草的ROS清除能力；與此同時降低了植株電解質(zhì)滲透率及MDA含量，來減輕細胞損傷程度，進而增強煙草非生物脅迫耐受性[34]。ZmbHLH105基因響應(yīng)逆境脅迫調(diào)控，錳(Mn)/鐵(Fe)相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的表達，通過增強ROS清除能力，提高玉米非生物脅迫耐受性[35]。甜橙(Citrussinensis)中CsbHLH18基因在煙草中過量表達，通過減少植株ROS的積累增強其耐寒性[36]。在低溫脅迫下，過表達PubHLH1的山梨(Pyrusussuriensis)品系較野生型具有更高的存活率，更低的電解質(zhì)滲透率及MDA含量。轉(zhuǎn)基因品系較野生型的ROS清除水平更高[37]。在鹽、干旱脅迫下，過表達TabHLH1的小麥品系體內(nèi)SOD、POD的活性較野生型顯著增強；在滲透脅迫條件下，H2O2含量明顯減少，表明TabHLH1響應(yīng)非生物脅迫，增強ROS清除水平，提高小麥非生物脅迫耐受性[12～13]。在擬南芥中，AtbHLH112通過與GCG-Box或E-Box結(jié)合調(diào)節(jié)基因的表達，提高ROS的清除能力，以增強擬南芥非生物脅迫耐受性[38]。

上述研究表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因能夠介導(dǎo)增強ROS清除能力與減輕細胞損傷程度來提高植物對非生物脅迫的耐受性。這與本研究中過表達AtUNE12基因提高擬南芥耐鹽能力的結(jié)果相符。本研究豐富了bHLH轉(zhuǎn)錄子家族抗逆基因功能研究的成果，為進一步系統(tǒng)闡述bHLH轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)非生物脅迫的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆了bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族中的AtUNE12基因并構(gòu)建其過表達載體，獲得了T3代過表達AtUNE12基因擬南芥。AtUNE12基因正向調(diào)控POD與SOD酶的活性，過表達AtUNE12基因增強了擬南芥的ROS清除能力，減少細胞受損程度，進而提高了擬南芥的耐鹽能力。