稻米中鉻的生物可給性及其對人體的健康風險評價

耿紫琪，王鵬飛，付雅祺，劉文菊，崔巖山,*

1. 中國科學院大學，北京 100049 2. 河北農業(yè)大學，保定 071000

鉻(chromium, Cr)，是一種常見的重金屬污染物。隨著工業(yè)的發(fā)展，Cr以工業(yè)三廢的形式存在于環(huán)境中的量越來越多。據統(tǒng)計數據顯示，我國受到Cr污染的土壤已超過2 000萬t[1]。隨著土壤Cr污染日益嚴重，由作物通過食物鏈進入人體的Cr逐漸蓄積，并可能對人體產生致癌效應[2]。水稻作為我國主要的糧食作物之一，也是重金屬Cr進入人體的重要途徑[3]。王曉波等[4]調查發(fā)現廣州市售大米中Cr的檢出率為100%，超標率為26.67%；王國莉[5]分析了144份惠州本地大米樣品中重金屬含量，其中，Cr的超標率為34.03%，可見研究稻米中Cr的生物可給性并將其用于人體健康風險評估具有十分重要的意義。

目前，在污染物對人體的健康風險評估中，主要有2種方法：(1)動物實驗(invivo)，用來評估生物有效性；(2)體外實驗(invitro)，用來評估生物可給性(bioaccessibility, BA)。由于動物實驗存在的周期長和個體間差異等問題[6]，使得invitro實驗的方法受到越來越多的關注。目前，國內外對稻米中Cr的生物可給性的研究主要集中于模擬胃和小腸階段[7-8]，但是由于結腸中存在著豐富的微生物，這些腸道微生物會影響食物中金屬的代謝[9-10]，因此在食物消化過程中，進入結腸的食物殘渣中的Cr同樣不能被忽略。可見僅僅考慮胃和小腸階段稻米中Cr的生物可給性，來評價人體健康風險是不夠全面的。利用人體腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)模擬物模型(simulator of human intestinal microbial ecosystem, SHIME)是在體外條件下模擬人體胃腸環(huán)境及微生物生態(tài)系統(tǒng)[11]。目前國內外有關于運用SHIME模型探究人體腸道微生物對土壤、食物中污染物代謝的報道[9-10,12]，但是對于稻米中Cr的研究報道較少。本研究采用生物可利用性提取模型(physiologically based extraction test, PBET)方法結合SHIME模型，探究稻米中的Cr在胃、小腸和結腸3個階段的生物可給性，并分析稻米中Cr的生物可給性的影響因子，特別是腸道微生物對Cr的代謝作用。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 稻米樣品

將從中國市場上收集了16個稻米樣品，按照傳統(tǒng)的稻米煮熟方式，以米/水1∶3(m∶m)的比例蒸煮30 min[9]，將煮熟的樣品冷凍干燥后，研磨過60目篩，得到的米粉一部分經微波消解儀(Mars6，CEM公司，美國)消解。消解過程如下：取0.2 g米粉于50 mL消解管中，加入5 mL濃硝酸(優(yōu)級純)、3 mL過氧化氫(優(yōu)級純)靜置過夜，次日設置消解溫度為80 ℃，緩慢加熱，持續(xù)30 min，升溫至120 ℃，保持1 h，消解完畢。轉移至趕酸器中于160 ℃趕酸至1～2 mL左右，冷卻至室溫后，用超純水定容至25 mL，過0.45 μm濾膜后，用電感耦合等離子體質譜儀(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry, ICP-MS)(Agilent 7500a，Thermo Fisher Scientific公司，美國)測定稻米中Cr的總量。另一部分米粉可用于invitro實驗研究。

1.2 in vitro實驗

本研究結合Ruby等[13]提出的PBET方法和SHIME模型[12]，實驗包括3個連續(xù)的階段，即胃階段、小腸階段和結腸階段。實驗具體操作步驟如下。

1.2.1 胃階段

配制模擬胃液(內含檸檬酸、蘋果酸、乳酸、冰乙酸和氯化鈉)，用濃鹽酸調pH至1.5，加入胃蛋白酶。取3 g稻米粉于50 mL離心管中，加入30 mL模擬胃液搖勻后再次測pH，用鹽酸調節(jié)pH在1.5左右。置于37 ℃、150 r·min-1的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中振蕩1 h，在1 h后，吸取5 mL反應液，過0.45 μm濾膜，4 ℃保存待測。

1.2.2 小腸階段

胃階段結束后在消化液中加入NaHCO3粉末，將消化液pH調至7.0左右，加入胰酶、膽鹽，測定pH并保證其在7.0±0.1。置于37 ℃、150 r·min-1的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中振蕩4 h，4 h后取出，吸取5 mL反應液，過0.45μm濾膜，4 ℃保存待測。

1.2.3 結腸階段

小腸階段結束后，將小腸消化液倒入100 mL厭氧血清瓶中，吸取SHIME模型降結腸中的反應液30 mL加入厭氧血清瓶，并迅速通入15～20 min氮氣保證厭氧環(huán)境。置于37 ℃、150 r·min-1的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，48 h后取出，吸取5 mL反應液，過0.45 μm濾膜，4 ℃保存待測。

胃、小腸和結腸階段消化液中的Cr含量采用ICP-MS進行測定，每個樣品在每個消化階段都做3個平行。實驗中所涉及到的試劑純度及廠商如表1所示。

1.3 計算方法

1.3.1 生物可給性

稻米中Cr在模擬胃、小腸和結腸3個階段的生物可給性可由式(1)計算。

BA=cV/cSMS×100%

(1)

式中：BA為稻米中Cr的生物可給性(%)；c為invitro實驗的胃、小腸或結腸階段反應液中Cr的可溶態(tài)含量(mg·L-1)；V為各反應器中反應液的體積(L)；cS為稻米樣品中Cr的含量(mg·kg-1)；MS為加入反應器中稻米樣品的質量(kg)[14]。

1.3.2 稻米中Cr的健康風險評估

稻米中的Cr每日暴露量(average daily dose, ADD)由式(2)計算。

ADD=cm×Wc×BA/Wb

(2)

式中：cm為稻米樣品中Cr的濃度(mg·kg-1)；Wc是每人每天消耗的稻米總量(kg·d-1)；BA是小腸階段Cr的生物可給性；Wb為成年人或兒童的平均體重(kg)。成年男子的體重為66.2 kg[15]，6歲男童的體重為23 kg[16]，成人每天稻米攝入量為389 g·d-1[17]，兒童為277 g·d-1[18]。稻米中Cr的健康風險指數危害商(hazard quotient, HQ)的計算方法由式(3)計算。

HQ=ADD/RfD

(3)

式中：Cr的參考劑量RfD為1.5 mg·kg-1·d-1[7]，如果HQ>1.0，就說明該稻米樣品存在健康風險。由于人體主要的吸收器官是小腸，因而用小腸部分Cr生物可給性的結果來計算人體健康風險。

1.4 數據分析

采用SPSS 24 (IBM)和Excel 2010軟件分析數據。

2 結果(Results)

2.1 稻米中Cr的含量

從市場上收集到的稻米樣品中Cr的含量如表2所示，其含量范圍為0.092～0.561 mg·kg-1，平均值為0.232 mg·kg-1，尚未超過國家食品衛(wèi)生標準(GB2762—2017)中規(guī)定的Cr的限量標準(1.0 mg·kg-1)[19]。

2.2 稻米中Cr溶解態(tài)及其在胃、小腸和結腸3個階段的生物可給性

稻米中Cr的溶解態(tài)含量及其生物可給性在3個階段中大體呈現逐漸升高的趨勢(表2和圖1)。模擬胃階段Cr的溶解態(tài)含量范圍為0.043～0.340 mg·kg-1，平均值為0.126 mg·kg-1，Cr的生物可給性范圍為34.3%～66.1%，平均值為52.5%；模擬小腸階段Cr的溶解態(tài)含量為0.052～0.455 mg·kg-1，平均值為0.179 mg·kg-1，Cr的生物可給性范圍為46.4%～89.1%，平均值為75.1%；模擬結腸階段Cr的溶解態(tài)含量范圍為0.067～0.481 mg·kg-1，平均值為0.195 mg·kg-1，Cr生物可給性范圍為64.4%～94.5%，平均值為83.0%。由胃階段至小腸階段，Cr的生物可給性上升了1.4倍，由小腸階段至結腸階段，Cr的生物可給性上升了1.1倍。

表1 實驗試劑及其廠商Table 1 Experimental reagents and their manufactures

圖1 16種稻米樣品中Cr在胃、小腸和結腸階段的生物可給性注：不同字母表示同一稻米樣品中Cr在胃、小腸和結腸階段生物可給性差異顯著(P<0.05)；圖中數據為樣本均值±標準偏差。Fig. 1 Bioaccessibility of Cr in stomach, small intestine and colon of 16 rice samplesNote: The different letters means the significant differences of bioaccessibility of Cr in the gastric, small intestinal and colon phases for the rice samples (P<0.05); the data were expressed as sample mean±standard deviation.

表2 稻米中Cr的總量以及各階段溶解態(tài)含量Table 2 The total concentration of Cr in rice and the dissolved concentration in each phase

2.3 人體的健康風險評估

在考慮小腸階段Cr的生物可給性和不考慮小腸階段Cr生物可給性2種情況下，按公式計算分析得到成人和兒童通過稻米途徑攝入Cr的每日暴露量(ADD)以及健康風險指數危害商(HQ)(表3)。當考慮Cr在小腸階段的生物可給性時，成人ADD范圍為3.04×10-4～2.67×10-3mg·kg-1·d-1，平均值為1.05×10-3mg·kg-1·d-1，HQ范圍為2.03×10-4～1.78×10-3，平均值為7.00×10-4；兒童ADD范圍為6.23×10-4～5.48×10-3mg·kg-1·d-1，平均值為2.15×10-3mg·kg-1·d-1，HQ范圍為4.15×10-4～3.65×10-3，平均值為1.44×10-3；不考慮生物可給性，成人ADD范圍5.40×10-4～3.30×10-3mg·kg-1·d-1，平均值為1.37×10-3mg·kg-1·d-1，HQ范圍為3.60×10-4～2.20×10-3，平均值為9.10×10-4；兒童ADD范圍為8.49×10-4～6.48×10-3mg·kg-1·d-1，平均值為2.22×10-3mg·kg-1·d-1，HQ范圍為5.66×10-4～4.32×10-3，平均值為1.48×10-3?？梢姵扇撕蛢和腍Q均<1.0，說明稻米樣品中的Cr對人體的健康風險較小。

3 討論(Discussion)

3.1 胃腸階段稻米中Cr的生物可給性

表3 稻米中Cr的健康風險評估Table 3 Health risk assessment of Cr in rice

3.2 結腸階段稻米中Cr的生物可給性

結腸階段，稻米中Cr的生物可給性為64.4%～94.5%，顯著高于小腸階段，是小腸階段的1.1倍，這一結果說明腸道微生物可促進稻米殘渣中Cr的溶出釋放。本實驗結果與前人的研究結果具有相同的規(guī)律。尹乃毅等的[12]研究表明，腸道微生物可促使土壤中Cr的溶出，使得結腸階段Cr的生物可給性高于小腸階段。Wang等[10]探究了結腸中微生物對蔬菜中Cr的生物可給性的影響，發(fā)現腸道微生物的作用增加了蔬菜中Cr的溶出。由于結腸中存在著豐富的微生物，且其代謝能力很強，未被消化吸收的稻米殘渣進入結腸階段后，其中的蛋白質和纖維可作為碳源和能源供腸道微生物利用[24]。微生物在代謝稻米殘渣中的有機質時，就有可能會將稻米殘渣上吸附的Cr釋放出來進入溶液，使液相中Cr的含量增加，生物可給性增加。

3.3 稻米攝入導致Cr的人體健康風險

稻米作為我國主要的糧食作物之一，對其重金屬的健康風險研究至關重要，也被學者廣泛關注。有研究表明，食物是人體攝入Cr的主要來源，其貢獻率最高可達98%[25]，因而，當Cr由稻米途徑進入人體，并在人體內蓄積過量后所造成的嚴重后果不容忽視[2]，研究Cr對人體的健康風險十分必要。Li等[7]將生物可給性的結果用于來自江蘇宜豐和太倉等5個地方的70種稻米樣品中Cr對人體的健康風險評估中，發(fā)現成人和兒童的HQ均遠<1.0。Praveena和Omar[8]計算了從馬來西亞市場收集的22種稻米樣品中Cr的生物可給性，并對稻米中Cr的健康風險進行評估，成人的HQ為8×10-4，兒童的HQ為5×10-3，二者均<1.0，表明稻米樣品中Cr對人體的健康影響較小。Omar等[26]評估了馬來西亞雪蘭莪州稻米中Cr的健康風險，發(fā)現所收集的22種稻米樣品中的Cr不存在對人體的潛在健康風險。在本研究中，對于從中國市場收集的16種稻米樣品，利用invitro實驗方法評估了稻米樣品中Cr對人體的健康風險。針對成人和兒童，在考慮和不考慮生物可給性2種情況下，成人和兒童的HQ均<1.0，表明這16種稻米的攝入不會引起人體健康風險，與前人的研究結果一致。