王林葉 吉冰璇 曾彥達(dá) 張啟軍 張美萍 呂川根

(1山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041004；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，江蘇 南京 210014)

人類(lèi)大量使用氯氟烴等物質(zhì)使大氣的臭氧層逐漸變薄，到達(dá)地面的UV-B(280～320 nm)輻射增強(qiáng)，對(duì)人類(lèi)活動(dòng)、動(dòng)植物和微生物生長(zhǎng)造成了嚴(yán)重影響[1-4]。增強(qiáng)UV-B輻射會(huì)造成植物的DNA 損傷[5-7]、生理生化過(guò)程發(fā)生紊亂[8-12]、生長(zhǎng)受阻并最終降低產(chǎn)量[13-16]。光氧化現(xiàn)象在水稻中普遍存在，早稻苗期長(zhǎng)期處于低溫陰雨天氣之后突然轉(zhuǎn)晴，或者生育后期長(zhǎng)期陰雨天氣后突然轉(zhuǎn)晴，亦或晚稻生育后期遭遇冷空氣侵襲后轉(zhuǎn)晴，這類(lèi)天氣都極易引發(fā)水稻光氧化現(xiàn)象[17]。水稻發(fā)生光氧化會(huì)導(dǎo)致葉片失綠(黃化)甚至死亡，從而影響稻谷產(chǎn)量[18]。水稻光氧化突變體812HS 來(lái)源于一個(gè)普通水稻不育系812S(野生型)，兩者農(nóng)藝性狀基本相同，在幼苗期兩者的葉色表型基本無(wú)差異，但在低溫寡照的江南梅雨季節(jié)過(guò)后、田間自然光照明顯增強(qiáng)的情況下，812HS的葉片表現(xiàn)出明顯的失綠現(xiàn)象，其野生型812S的表型并無(wú)明顯變化，而在光強(qiáng)中等或較弱時(shí)，812HS的整體葉色又可恢復(fù)為正常綠色[19]。研究表明，812HS是研究水稻葉片光氧化特性的好材料，其光氧化特性由一個(gè)新基因LPO控制[20]。812HS的光氧化現(xiàn)象由強(qiáng)光引起，增強(qiáng)UV-B輻射是否會(huì)加劇對(duì)812HS或其他光氧化水稻葉色表型的影響，影響程度是否強(qiáng)于普通水稻等，目前鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以812HS為材料，以其野生型812S 代表普通水稻，研究UV-B 增強(qiáng)輻射對(duì)812HS的光合生理及生長(zhǎng)的影響，旨在為水稻光氧化現(xiàn)象研究提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及其培養(yǎng)

以水稻光氧化株系812HS(突變體)為試驗(yàn)材料，以其野生型812S 代表普通水稻(對(duì)照)。于2018年5-8月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所(32°03′N(xiāo)、118°47′E)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。盆缽直徑20 cm，高25 cm。水稻種子經(jīng)浸種、催芽后直播于盆缽，每個(gè)處理重復(fù)6次(盆)。三葉期留取生長(zhǎng)狀況基本一致的幼苗，每盆3 穴，每穴1 苗，采用常規(guī)水肥管理。

1.2 輻射處理

設(shè)置2個(gè)處理組，即增強(qiáng)UV-B輻射處理和自然光對(duì)照。增強(qiáng)UV-B輻射下生長(zhǎng)的812HS 記為L(zhǎng)1，812S 記為L(zhǎng)2。自然光條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)對(duì)照812HS記為CK1，812S 記為CK2。在室外自然條件下，將UV-B 燈管等距離水平懸掛于水稻植株上方，通過(guò)調(diào)節(jié)UV-B 燈架與植株頂端間的距離來(lái)控制輻射劑量，采用40 kJ·m-2·d-1劑量[相當(dāng)于增強(qiáng)本地自然光中UV-B輻射量的40%左右，用XP-4000 紫外強(qiáng)度計(jì)(上海遂歐儀器有限公司)核定]的UV-B輻射處理，每天白天處理9 h(陰雨天除外)，共計(jì)處理65 d。

1.3 水稻各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定方法

1.3.1 葉綠素含量的測(cè)定 分別于幼苗期、分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期使用SPAD-502Plus SPAD 儀(常州德圖精密儀器有限公司)測(cè)定距葉尖三分之一處的葉綠素含量。每個(gè)處理測(cè)定10 張葉片，取平均值。

1.3.2 灌漿期葉綠素合成代謝中間產(chǎn)物

1.3.2.1 5-基乙酰丙酸含量的測(cè)定 參照王凌健等[21]的方法并略加改動(dòng)。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g 葉片并用液氮研磨，按照1∶5的體積比加入4%三氯乙酸充分研磨成漿并定容至20 mL，8 000×g離心5 min；取1 mL 上清液加入0.5 mL 1 mol·L-1醋酸鈉和50 μL 乙酰丙酮，充分搖勻后100℃水浴10 min，放置室溫冷卻后于8 000×g離心5 min，取1.5 mL 上清液加入1.5 mL Ehrlich-Hg 顯色劑(取2 g 對(duì)-二甲氨基苯甲醛加入60 mL 冰醋酸，再加入16 mL 高氯酸，用冰醋酸定容至100 mL，最后加入0.3 g 氯化汞)，暗處理15 min 后用GS54 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)測(cè)定553 nm 波長(zhǎng)處的OD值。5-基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)含量以553 nm的消光系數(shù)7.2×104L·mol-1·cm-1計(jì)算。

1.3.2.2 膽色素原含量的測(cè)定 參照Bogorad[22]的方法。稱(chēng)取0.5 g 葉片，用液氮充分研磨，加入5 mL緩沖液(0.1 mol·L-1EDTA、0.6 mol·L-1Tris，pH值8.2)，于12 000×g條件下離心10 min。取上清液2 mL，加入2 mL Ehrlich-Hg 顯色劑，暗處理15 min 后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定553 nm 波長(zhǎng)處的OD值。膽色素原(porphobilinogen，PBG)含量以553 nm的消光系數(shù)6.1×104L·mol-1·cm-1計(jì)算。

1.3.2.3 尿卟啉原Ⅲ含量的測(cè)定 參照Bogorad[22]的方法。稱(chēng)取1 g 葉片，加入液氮研磨后再加入10 mL 0.067 mol·L-1PBS 緩沖液(pH值6.8)研磨成漿，12 000×g離心10 min。吸取5 mL 上清液，加入0.25 mL 1%Na2S2O3，漩渦震蕩并用強(qiáng)光照射20 min，然后用1 1 mol·L-1冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至3.5，用8 mL 乙醚反復(fù)萃取3次，測(cè)定水相在405.5 nm 波長(zhǎng)處的OD值；乙醚萃取液合并后用3 mL 0.1 mol·L-1鹽酸萃取，測(cè)定鹽酸相在395.5 nm 處的OD值。尿卟啉原Ⅲ(urogenⅢ)含量以消光系數(shù)5.48×105L·mol-1·cm-1計(jì)算。

1.3.2.4 原卟啉Ⅸ、鎂原卟啉Ⅸ和原脫植基葉綠素含量的測(cè)定 參照Hodgins 等[23]的方法。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.3 g 葉片，加入25 mL 80%堿性丙酮，充分研磨后于4℃條件下15 000×g離心15 min，吸取上清液后分別在575、590和628 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。原卟啉Ⅸ(ProtoⅨ)、鎂原卟啉Ⅸ(Mg-ProtoⅨ)和原脫植基葉綠素(Pchlide)含量計(jì)算公式如下:

1.3.3 葉綠素a 熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定 按照Strasser 等[24]的方法，使用HandyPEA 連續(xù)激發(fā)式熒光儀(Hansatech，英國(guó))測(cè)量葉綠素a 熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。用夾子夾住水稻葉片，暗處理20 min 后用光量子為3 000 μmol·m-2·s-1的飽和紅閃光照射，儀器自動(dòng)記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)，采用PEA Plus Hansated 軟件計(jì)算和分析數(shù)據(jù)。每個(gè)處理測(cè)量6 張葉片，取平均值。

1.3.4 分蘗數(shù)、有效分蘗數(shù)和株高的測(cè)定 每個(gè)處理隨機(jī)選取12株水稻，計(jì)數(shù)分蘗數(shù)和有效分蘗數(shù)，取平均值；測(cè)量每個(gè)植株基部至穗頂部的高度，以平均值作為株高。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用Microsoft Office Excel 2017和SPSS 21.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。采用t檢驗(yàn)方法、單因素方差分析和Duncan’s 多重比較進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)水稻葉綠素含量的影響

由圖1可知，L1和L2的葉綠素含量變化趨勢(shì)基本一致，在分蘗期至抽穗期均上升，在抽穗期和灌漿期均下降。與相應(yīng)的CK1和CK2相比，L1和L2的葉綠素含量在分蘗期均顯著減少(P＜0.05)，L1的降幅顯著低于L2(少降4.7個(gè)百分點(diǎn)，P＜0.05)。生長(zhǎng)中后期，812HS的葉綠素含量?jī)?yōu)勢(shì)更明顯，在抽穗期，相比于L2的無(wú)變化(與CK2 比)，L1 則顯著提高了15.3%(與CK1 比)(P＜0.05)；在灌漿期，L1 較CK1 顯著增加了48.7%(P＜0.05)，比L2的增幅(與CK2 比)多34.4個(gè)百分點(diǎn)，差異極顯著(P＜0.01)。

圖1 增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)水稻葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of enhanced UV-B radiation on the chlorophyll content of rice

2.2 增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)水稻灌漿期葉綠體合成代謝中間產(chǎn)物的影響

由圖2-A、E可知，增強(qiáng)UV-B輻射后，與CK1相比，L1 膽色素原含量降低了29.7%，而原卟啉Ⅸ含量增加了38.2%，導(dǎo)致灌漿期葉綠素含量仍然增加。由圖2-B、C、D、F可知，其他指標(biāo)均無(wú)顯著變化。上述結(jié)果表明，增強(qiáng)UV-B輻射使812HS 在灌漿期的原卟啉Ⅸ的合成量增多，導(dǎo)致葉綠素含量增加，

由圖2-B可知，增強(qiáng)UV-B輻射后，在葉綠素生物合成過(guò)程中，與CK2相比，L2的原脫植基葉綠素含量增加了55.4%。由圖2-A、C、D、E、F可知，其他指標(biāo)均無(wú)顯著變化。上述結(jié)果表明，原脫植基葉綠素含量的增加會(huì)導(dǎo)致L2 葉綠素含量增加。

綜上，增強(qiáng)UV-B輻射會(huì)影響812HS 在葉綠素的生物合成過(guò)程中的膽色素原、原卟啉Ⅸ的合成，以及普通水稻中原脫植基葉綠素的合成。

2.3 增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)葉綠素a 熒光參數(shù)的影響

2.3.1 增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)PSⅡ光合性能的影響 由圖3可知，L1 與L2的Fv/Fm值變化趨勢(shì)基本一致。與自然光生長(zhǎng)相比，在拔節(jié)期，L1的Fv/Fm值降低3.9%(P＜0.05)，同時(shí)，F(xiàn)O增加11.6%，F(xiàn)m降低9.6%；在灌漿期，L1的Fv/Fm值基本無(wú)變化，而L2 增加了4.9%(P=0.03)，同時(shí)，L2的FO降低22.4%，F(xiàn)m降低11%。以上結(jié)果說(shuō)明，增強(qiáng)UV-B輻射后，812HS和812S的PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率均降低。812HS的光合反應(yīng)中心在拔節(jié)期遭到破壞，出現(xiàn)光抑制，而812S 則在灌漿期天線(xiàn)色素降解，光合反應(yīng)中心失活，其PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率卻升高，這可能與葉綠素含量增加有關(guān)。

由圖3-A可知，L1 與L2的Fv/Fm值均在幼苗期至拔節(jié)期下降，拔節(jié)期至抽穗期升高，灌漿期又下降。與自然光生長(zhǎng)相比，L1 分蘗期的Fv/Fm值顯著增加3.2%(P＜0.05)，較L2的增幅高1.8個(gè)百分點(diǎn)，但差異不顯著；在拔節(jié)期，L1的Fv/Fm值顯著降低3.9%，較L2 降幅多1.4個(gè)百分點(diǎn)(P＞0.05)；在灌漿期，L1的Fv/Fm值基本無(wú)變化，而L2 顯著增加了4.9%(P＜0.05)。綜上說(shuō)明，增強(qiáng)UV-B輻射提高了812HS 分蘗期PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率，且比812S 提高效率更明顯，但降低了其在拔節(jié)期和灌漿期的PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率。

由圖3-B可知，L1 與L2的FO值變化趨勢(shì)基本一致，幼苗期至拔節(jié)期升高，拔節(jié)期至抽穗期下降，隨后又升高。在拔節(jié)期，L1的FO值與CK1相比增加了11.6%，而L2 與CK2相比無(wú)明顯變化，表明L1的PSⅡ光合結(jié)構(gòu)被破壞或者發(fā)生可逆失活，導(dǎo)致原初光化學(xué)效率下降。在灌漿期，L1的FO值與CK1 間無(wú)明顯差異，而L2 較CK2 顯著增加了22.4%，說(shuō)明812HS的天線(xiàn)色素不受影響，而普通水稻的天線(xiàn)色素明顯降解。

由圖3-C可知，L1和L2的Fm值在幼苗期和分蘗期均上升，隨后，L1 表現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，而L2 有繼續(xù)平穩(wěn)上升的趨勢(shì)；在抽穗期，L1的Fm值顯著降低9.6%，而L2 無(wú)顯著差異；在灌漿期，L1 無(wú)顯著差異，但L2 顯著降低11%，表明812HS 在抽穗期出現(xiàn)了光抑制，而812S 則在灌漿期出現(xiàn)光抑制。

2.3.2 增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)熒光動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)的影響 由圖4-A、B可知，與自然光生長(zhǎng)相比，2個(gè)水稻的OJIP曲線(xiàn)在分蘗期和拔節(jié)期J-Ⅰ相均降低，表明快還原型庫(kù)PQ 遭到破壞，電子從QA-向QB-傳遞過(guò)程受阻，光合結(jié)構(gòu)被破壞或者發(fā)生可逆失活。由圖4-C可知，在抽穗期，2個(gè)水稻的OJIP 曲線(xiàn)均無(wú)明顯變化；在灌漿期，與自然光生長(zhǎng)相比，L1的熒光動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)無(wú)顯著變化，而L2的O、J、Ⅰ、P 點(diǎn)均下降，PSⅡ的電子傳遞受到抑制(圖4-D)。

圖2 增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)水稻葉綠素合成中間代謝產(chǎn)物的影響Fig.2 Effects of enhanced UV-B radiation on intermediate metabolites of chlorophyll synthesis in rice

上述結(jié)果表明，增強(qiáng)UV-B輻射后，812HS 在拔節(jié)期的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線(xiàn)(OJIP)受到影響，其快還原型庫(kù)PQ 遭到破壞，電子從QA-向QB-傳遞過(guò)程受阻，而812S 則在拔節(jié)期和灌漿期均受影響，光合結(jié)構(gòu)被破壞或者發(fā)生可逆失活。

2.4 增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)水稻生長(zhǎng)特性的影響

由圖5可知，與自然光生長(zhǎng)相比，2個(gè)水稻的分蘗數(shù)和有效分蘗數(shù)均減少，株高均降低。L1的分蘗數(shù)、有效分蘗數(shù)和株高分別下降10.0%、16.3%、12.9%，其中株高的降幅較L2(14.6%)少2.0個(gè)百分點(diǎn)，兩者差異顯著(P＜0.05)。表明增強(qiáng)UV-B輻射使812HS和812S的生長(zhǎng)量均降低，但812HS 受到的傷害較812S 輕，說(shuō)明增強(qiáng)UV-B輻射812HS 農(nóng)藝性狀的影響弱于812S。

圖3 增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)水稻PSⅡ光合性能的影響Fig.3 Effect of enhanced UV-B radiation on PSⅡphotosynthetic properties of rice

3 討論

植物的形態(tài)、生理特征和生長(zhǎng)量的變化可準(zhǔn)確反映外界環(huán)境的影響，UV-B輻射的影響最終體現(xiàn)在植物的生長(zhǎng)上，且因植物品種的不同和輻射劑量的大小而異，不同品種或者同一品種在不同發(fā)育時(shí)期對(duì)UV-B輻射敏感度也有不同[25-26]。增強(qiáng)UV-B 抑制水稻生長(zhǎng)，使植株分蘗數(shù)、有效分蘗數(shù)減少，植株矮化[27-29]。本試驗(yàn)中，增強(qiáng)UV-B輻射65 d 后，812HS和812S的分蘗數(shù)和有效分蘗數(shù)均減少，植株均矮化，2個(gè)品種的分蘗數(shù)和有效分蘗數(shù)降幅無(wú)顯著差異，但812HS株高的降幅顯著小于812S，表明增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)光氧化水稻812HS 生長(zhǎng)的抑制程度弱于普通水稻。唐莉娜等[30]研究表明，增強(qiáng)UV-B輻射抑制水稻生長(zhǎng)，使株高變矮，分蘗數(shù)減少，本研究與此結(jié)論一致。

光合作用與植物的生長(zhǎng)和發(fā)育密切相關(guān)，光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是葉綠素，其含量高低直接影響植物對(duì)光能的吸收和傳遞。本研究中，增強(qiáng)UV-B輻射后，812HS的葉綠素含量在分蘗期顯著減少，抽穗期后顯著增加，尤其是在灌漿期，其增幅較普通水稻高，可能是植株幼嫩葉片(分蘗期)突然遭受UV-B輻射時(shí)葉綠素合成受阻，隨后，植株逐漸適應(yīng)了UV-B輻射并啟動(dòng)了某些機(jī)制，如葉綠素生物合成中增強(qiáng)UV-B輻射使得812HS 分蘗期的PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)提高，在拔節(jié)期有所降低，這與普通水稻無(wú)差別，但812HS光合特性在灌漿期不受顯著影響，而普通水稻的FO和Fm均降低，這可能與光合作用相關(guān)的其他一些因子受到影響有關(guān)，如內(nèi)源激素等[31]，此方面尚有待進(jìn)一步深入研究。812HS 拔節(jié)期Fv/Fm值降低。FO值升高，F(xiàn)m降低，同時(shí)J-Ⅰ相降低，說(shuō)明電子從向的傳遞過(guò)程受阻，快還原型PQ 庫(kù)遭到破壞，使得PQs和PSI 蛋白復(fù)合體失活。這與喬媛等[32]的研究結(jié)果一致。而增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)812S 生長(zhǎng)的抑制程度更強(qiáng)，其天線(xiàn)色素含量降低，光合結(jié)構(gòu)被破壞或者發(fā)生可逆失活，在灌漿期OJIP 曲線(xiàn)整體下降，發(fā)生光損傷、光抑制、光氧化，這種現(xiàn)象在光氧化水稻812HS中并不明顯。周黨衛(wèi)等[33]曾報(bào)道，增強(qiáng)UV-B輻射會(huì)降低葉片的光合色素。但本研究結(jié)果表明，增強(qiáng)UV-B輻射并不會(huì)明顯降低光氧化水稻812HS的天線(xiàn)色素。具體原因尚有待深入研究。

圖4 增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)水稻OJIP 曲線(xiàn)的影響Fig.4 Effect of enhanced UV-B radiation on OJIP curve of rice

圖5 增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)水稻生長(zhǎng)特性的影響Fig.5 Effect of enhanced UV-B radiation on growth characteristic of rice

4 結(jié)論

增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)光氧化水稻812HS和普通水稻均有不利影響，但對(duì)光氧化水稻812HS的光合作用損傷和生長(zhǎng)抑制程度弱于普通水稻。造成傷害的主要原因是快還原型PQ 庫(kù)遭到破壞，PQf和QB蛋白復(fù)合體失活，導(dǎo)致光合能力下降。本研究結(jié)果為夏季強(qiáng)光下的作物栽培和強(qiáng)光防護(hù)設(shè)施栽培提供了一定的理論參考。