李 萍 陳小娥 方旭波 劉 妍 竹 琳 余 輝 郭 健 員立萍

(1浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022；2浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316022；3陜西好時(shí)鮮海洋生物科技有限公司，陜西 西安 710000)

虎斑烏賊(Sepia pharaonis)是我國(guó)主要的頭足類經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一，隸屬軟體動(dòng)物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、十腕目 (Decapoda)、烏賊科(Sepiidae)、烏賊屬(Sepia)，主要分布在菲律賓群島、日本列島海域及我國(guó)東海、南海海域，具有個(gè)體大、生長(zhǎng)快等特點(diǎn)[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)虎斑烏賊的研究主要集中在繁殖生物學(xué)、營(yíng)養(yǎng)成分和養(yǎng)殖技術(shù)等方面[3]，而在食品加工業(yè)中虎斑烏賊墨多作為廢棄物，其潛在的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值沒(méi)有得到較好的利用[4]。

烏賊墨黑色素是一種由小低聚物分子組成的不溶于水的生物大分子[5]，其化學(xué)成分是黑色素和蛋白多糖復(fù)合體[6]，具有抗氧化[7-8]、抗腫瘤[9]、抗輻射[10]、抑菌[11]等功能。在日本和歐美，烏賊墨黑色素已作為一種天然食材被添加到食品中[8]，但在我國(guó)食品加工行業(yè)的應(yīng)用尚處于起步階段，可能是烏賊墨黑色素顆粒大小不均勻、溶解性差、口感不細(xì)膩等原因限制了其在食品中的推廣應(yīng)用。動(dòng)態(tài)高壓微射流(dynamic high pressure microfluidization，DHPM)是集輸送、混合、濕法粉碎、均質(zhì)等多單元操作于一體的新型非熱加工和物理改性技術(shù)。該技術(shù)以超高壓、流體力學(xué)及撞擊流理論為依據(jù)，利用高壓使液體物料高速流過(guò)狹窄的縫隙時(shí)使其受到強(qiáng)烈剪切、高速撞擊、劇烈震蕩、壓力瞬間釋放等綜合動(dòng)力作用[12]，實(shí)現(xiàn)物料的均一化和超細(xì)微化，從而對(duì)其理化性質(zhì)產(chǎn)生影響，以提高機(jī)體對(duì)其的吸收利用率[13-14]。

近幾年，DHPM 主要用于食品大分子改性[15]、滅菌[13]、生物活性分子提取[16]等，但有關(guān)DHPM處理對(duì)烏賊墨黑色素物理性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究以虎斑烏賊墨囊為試驗(yàn)原料，采用DHPM技術(shù)，在酶解制備黑色素的基礎(chǔ)上，研究改性處理對(duì)其濁度、粒度、流變特性、色值、溶解性和貯藏穩(wěn)定性等物理性質(zhì)及微觀結(jié)構(gòu)的影響，旨在為強(qiáng)化天然食品原料功能因子提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

-45℃冷凍的虎斑烏賊墨囊，陜西好時(shí)鮮海洋生物科技有限公司；堿性蛋白酶(200 000 U·g-1)，南寧龐博生物工程有限公司；氫氧化鈉、溴化鉀、丙三醇等試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AMH-3 高壓微射流均質(zhì)機(jī)，安拓思納米技術(shù)(蘇州)有限公司；美能達(dá)CM-5 臺(tái)式分光測(cè)色儀，天友利標(biāo)準(zhǔn)光源寧波有限公司；NICOMP 380DLS 納米粒徑分析儀，美國(guó)Pss 粒度儀公司；DHR-2 流變儀，英國(guó)TA公司；日立S-3400N 掃描電子顯微鏡，日本日立公司；DSC-200 F3 差示掃描量熱儀，德國(guó)耐馳公司；Nicolet 6700 紅外光譜儀，美國(guó)Thermo Nicolet 公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；UV-5900 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；TDL-5-A型大功率低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DSHZ-300 旋轉(zhuǎn)式恒溫震蕩器，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；FA25-20DG 均質(zhì)機(jī)，上海弗魯克科技發(fā)展有限公司；DL-180B型超聲清洗儀，上海之信儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 烏賊墨黑色素酶解液的制備 參考周月越等[17]的方法。冷凍虎斑烏賊墨囊→流水解凍→剪破墨囊擠出墨汁→等體積去離子水浸泡過(guò)夜→8 000 r·min-1常溫離心10 min→去除上清液，沉淀于-40℃真空冷凍干燥24 h→獲得烏賊墨黑色素粗品→向粗品中加入料液比1∶50(質(zhì)量比)的去離子水→用5 mol·L-1鹽酸或5 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至10.5→加入堿性蛋白酶4 200 U·g-1(即每克烏賊墨黑色素粗品中加入4 200 U 堿性蛋白酶)，50℃保溫酶解4 h→100℃沸水浴加熱10 min 滅酶活→過(guò)200 目篩，將烏賊墨黑色素濾液置于4℃冰箱備用。

1.3.2 紫外-可見(jiàn)光譜掃描 將1.3.1 中制備好的酶解液多次常溫離心(8 000 r·min-1，10 min)、水洗至中性，其沉淀在-40℃條件下真空冷凍干燥(24 h)為烏賊墨黑色素粉末。取2 mg 粉末溶解于30 mL 0.05 mol·L-1氫氧化鈉溶液，50℃水浴加熱10 min 得到穩(wěn)定的黑色素溶液，于190～790 nm 波長(zhǎng)范圍進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜掃描，采樣間隔1.0 nm，確定特征吸收波長(zhǎng)。

1.3.3 DHPM處理 將1.3.1 中制備好的烏賊墨黑色素酶解液于均質(zhì)機(jī)中3 000 r·min-1預(yù)處理50 s，然后采用DHPM 分別在不同壓力(40、80、120、160、200 MPa)下處理樣品，備用。同時(shí)，以未處理(0 MPa)烏賊墨黑色素酶解液作為對(duì)照組，測(cè)定所有樣品組的相關(guān)指標(biāo)。

1.3.4 DHPM處理烏賊墨黑色素物理性質(zhì)測(cè)定

1.3.4.1 濁度 取1.3.3 處理后的樣品適量，4 000 r·min-1常溫離心10 min，取等量上清液用0.05 mol·L-1氫氧化鈉稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，充分混勻，以去離子水為空白對(duì)照。將樣品置于2 cm 比色皿中，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在特征吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值。

1.3.4.2 粒度 取1.3.3 處理后的樣品適量，用去離子水作為分散劑將樣品稀釋到料液比為1∶10，在頻率40 kHz、功率500 W條件下超聲處理6 min，用納米粒徑分析儀于室溫下測(cè)定烏賊墨黑色素的粒度分布和顆粒的平均粒徑。

1.3.4.3 流變學(xué)特性 用流變儀表征烏賊墨黑色素表觀流變學(xué)特性。選擇直徑為40 mm的不銹鋼平板測(cè)量系統(tǒng)，間隙0.5 mm，加樣后，進(jìn)行切邊處理，加入硅油以防止溶液外流，每次測(cè)試均更換樣品[13]。25℃條件下，剪切速率(γ)10～200 s-1遞增，分別測(cè)定烏賊墨黑色素表觀黏度η 隨剪切速率的變化情況。

1.3.4.4 色差 用分光測(cè)色儀分別測(cè)定樣品空間色度值。L*值表示亮度；a*值表示紅綠色度；b*值表示黃藍(lán)色度；C*值表示飽和度。根據(jù)公式計(jì)算總色差(ΔE):

式中，ΔL*表示試樣與對(duì)照組的L值的差值；Δa*表示試樣與對(duì)照組的a值的差值；Δb*表示試樣與對(duì)照組的b值的差值。

1.3.4.5 溶解性 參考宋茹等[18]的方法，將1.3.3處理后的樣品于-40℃條件下真空冷凍干燥24 h，準(zhǔn)確稱取樣品0.05 g 于50 mL 燒杯中，在室溫(25℃)下分別加入10 mL 去離子水、生理鹽水、丙三醇、乙酸、丙酮、二甲基亞砜和0.05 mol·L-1氫氧化鈉溶液，充分渦旋混合，靜置10 min，觀察其在不同溶液中的溶解情況和溶液顏色的變化。

1.3.4.6 熱穩(wěn)定性 采用差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)測(cè)定烏賊墨黑色素的熱變性溫度。取1.3.3 各處理后樣品溶液10.0 μL 置于鋁坩堝(精確到0.1 μL)中，從35℃升溫至175℃，以10℃·min-1升溫速率掃描，以空坩堝為參比，氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)氣進(jìn)行測(cè)試，并由DSC 分析曲線及特征值變化觀察DHPM處理對(duì)樣品熱變性溫度的影響。

1.3.4.7 貯藏穩(wěn)定性 取1.3.3 處理后的樣品10 mL 裝入試管中，密封后置于試管架上放入4℃冰箱，30 d 后觀察樣品是否分層，并取分層后最上層的樣品0.5 mL，采用1.3.4.2的方法測(cè)定各處理組樣品的平均粒徑，觀察貯藏時(shí)間對(duì)烏賊墨黑色素粒徑的影響，從而判定DHPM 對(duì)烏賊墨黑色素貯藏穩(wěn)定性的影響。

1.3.5 DHPM 對(duì)烏賊墨黑色素微觀結(jié)構(gòu)的影響

1.3.5.1 紅外光譜分析 將1.3.3 處理后樣品于-40℃條件下真空冷凍干燥24 h，然后與溴化鉀干粉按照質(zhì)量比1∶100 混合均勻，置于模具中，均勻加壓得到待測(cè)樣片，用紅外光譜儀掃描4 000～400 cm-1波長(zhǎng)范圍的光譜吸收值。

1.3.5.2 顆粒形貌分析 參考李和生等[8]的方法。將1.3.3 處理后樣品溶液于-40℃條件下真空冷凍干燥24 h，取少量粉末黏著于導(dǎo)電膠帶，離子濺射儀噴金處理，掃描電子顯微鏡對(duì)其進(jìn)行形態(tài)掃描、拍照，觀察不同處理組烏賊墨黑色素顆粒的表面微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 9.1 軟件繪圖，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18.0 軟件處理數(shù)據(jù)和方差分析，Tukey 法檢驗(yàn)差異顯著性，顯著性水平為P＜0.05，每個(gè)試驗(yàn)均平行測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 虎斑烏賊墨黑色素的紫外-可見(jiàn)光譜分析

堿性蛋白酶酶解法制備的虎斑烏賊墨黑色素的紫外-可見(jiàn)光譜吸收如圖1所示，在紫外光區(qū)域(190～400 nm)內(nèi)，221 nm 處存在明顯的特征吸收峰，而在可見(jiàn)光區(qū)域(400～750 nm)內(nèi)未出現(xiàn)特征吸收峰，且其吸光度值隨著波長(zhǎng)的增大逐漸降低。這與文獻(xiàn)報(bào)道中其他黑色素的全波長(zhǎng)掃描結(jié)果接近，如李興旺等[19]采用酸解法制備的魷魚墨黑色素在可見(jiàn)光區(qū)域內(nèi)未檢測(cè)到明顯吸收峰，在200～400 nm 范圍內(nèi)存在兩處吸收峰，其中一處強(qiáng)吸收峰處于215 nm；李曉等[20]采用酶解法制備的金烏賊墨黑色素在波長(zhǎng)206和557 nm 處均檢測(cè)出明顯吸收峰；周月越等[17]采用酶解法制備的曼氏無(wú)針烏賊墨黑色素在222.5 nm 處檢測(cè)到一明顯特征吸收峰。因此，后續(xù)試驗(yàn)以221 nm 作為特征測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素溶液濁度的影響

圖1 虎斑烏賊墨黑色素的紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig.1 Ultraviolet-visible spectrum of sepia pharaonis melanin derived from Sepia pharaonis ink

不同DHPM處理組烏賊墨黑色素在221 nm 處的吸光度值如圖2所示，其吸光度值的大小可反映樣品溶液濁度的情況，從而顯示出溶液的顆粒懸浮穩(wěn)定性。結(jié)果表明，不同壓力處理組的烏賊墨黑色素溶液濁度之間有顯著差異(P＜0.05)，且隨著壓力的增大，其吸光度值先明顯增大后逐漸減小，這可能是由于在0～120 MPa時(shí)，原存在于黑色素溶液中的部分聚集物發(fā)生了解聚集作用，當(dāng)壓力大于120 MPa時(shí)，高壓產(chǎn)生的熱力作用使得黑色素顆粒之間又重新聚集，吸光度值逐漸減小[21-22]，即濁度減小。

圖2 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素溶液濁度的影響Fig.2 Effects of DHPM treatments on turbidity of the melanin solution of Sepia pharaonis ink

與對(duì)照組相比，在40～120 MPa 范圍內(nèi)，DHPM處理顯著增加了黑色素溶液的懸浮穩(wěn)定性，其溶液的吸光度值和濁度增大，這是由于DHPM 對(duì)黑色素溶液的高剪切力等作用使其顆粒分散更加均勻細(xì)微化，黑色素分子與水分子之間的氫鍵增強(qiáng)，可溶性成分增多，從而使得離心后上清液中顆粒溶解增多[13]。

2.3 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素溶液粒度的影響

由表1和圖3可知，DHPM處理明顯影響了虎斑烏賊墨黑色素溶液的粒度分布和平均粒徑。對(duì)照組黑色素的粒度分布均呈多峰分布且分布尺寸較寬，粒度主要分布在151.90～305.90 nm之間，且25%的顆粒大于246.20 nm，平均粒徑為206.30 nm；不同DHPM壓力處理組黑色素溶液的平均粒徑均小于對(duì)照組樣品，粒度分布均向小粒子峰移動(dòng)，且隨壓力的增大(0～120 MPa)，粒度跨度逐漸減小，峰分布變窄，粒度分布更均一，尤其在120 MPa 有較大變化，峰移動(dòng)幅度達(dá)到最大，平均粒徑達(dá)到最小值(101.20 nm)，說(shuō)明樣品在加速進(jìn)入反應(yīng)器時(shí)，在極小的空間內(nèi)被強(qiáng)烈的垂直撞擊，使其作用過(guò)程中瞬間產(chǎn)生巨大的能量，從而產(chǎn)生一定的壓力降，導(dǎo)致樣品顆粒高度破碎，聚集體解聚成更小的黑色素分子[23]。當(dāng)壓力大于120 MPa時(shí)，黑色素顆粒的平均粒徑略有增加，樣品粒度分布又逐漸向大粒子峰偏移，這可能是由于樣品通過(guò)DHPM 均質(zhì)機(jī)時(shí)，在高壓力的熱力作用下，其能量輸入和能量密度過(guò)大，之前破碎的小分子顆粒又重新聚合，導(dǎo)致粒徑略微增加[24]。綜上，DHPM處理對(duì)烏賊墨黑色素粒度起到了細(xì)微化和集中分布的作用。

表1 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素溶液顆粒粒度的影響Table1 Effects of DHPM treatments on solution particle size of the melanin of Sepia pharaonis ink

圖3 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素溶液顆粒粒度分布的影響Fig.3 Effects of DHPM treatments on solution particle size distribution of the melanin of Sepia pharaonis ink

2.4 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素溶液流變學(xué)特性的影響

剪切速率由10 s-1增加至200 s-1期間進(jìn)行了20次測(cè)量。由圖4可知，隨著剪切速率的增大，黑色素溶液的表觀粘度整體呈下降并逐漸趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)剪切速率小于80 s-1時(shí)，隨著剪切速率的增大，溶液粘度下降較為明顯，剪切速率大于80 s-1時(shí)，溶液粘度則趨于平緩，表現(xiàn)出明顯的假塑性流體所特有的剪切變稀特性，所以烏賊墨黑色素溶液為“非牛頓流體”[13]。這是由于在10～80 s-1范圍內(nèi)，隨著剪切速率的增大，黑色素溶液的分散狀態(tài)發(fā)生了改變，流層間的剪切應(yīng)力減小，導(dǎo)致粘度下降；當(dāng)剪切速率超過(guò)80 s-1后，上述分子間的排列趨于完善狀態(tài)，即分子間排列基本完畢，表觀粘度趨于穩(wěn)定。

與對(duì)照組相比，DHPM處理組剪切變稀特性更為明顯，但不同處理組均未改變黑色素溶液的流體類型。這可能是由于DHPM處理能使黑色素顆粒變細(xì)膩且分散程度集中、均勻，隨著剪切速率的增大，黑色素聚集體表面親水性略微增強(qiáng)，氫鍵等一些弱鍵斷裂，導(dǎo)致黑色素聚集體分散解離，降低了溶液的流動(dòng)阻力[25]。整體來(lái)看，與對(duì)照組相比，DHPM處理使樣品的粘度增大，說(shuō)明DHPM處理對(duì)烏賊墨黑色素的結(jié)構(gòu)有一定的影響，進(jìn)而改變其表觀粘度。

圖4 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素溶液表觀粘度的影響Fig.4 Effects of DHPM treatments on apparent viscosity of the melanin solution of Sepia pharaonis ink

2.5 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素溶液色差的影響

由表2可知，DHPM處理組L*值均較對(duì)照組顯著增加(P＜0.05)，表明與對(duì)照組樣品相比，DHPM處理樣品的亮度均有所增加，尤其是120 MPa 處理組樣品亮度增加最明顯。與對(duì)照組相比，不同DHPM處理對(duì)黑色素溶液的a*值、b*值和C*值也有顯著影響(P＜0.05)，表明隨著壓力的增大，黑色素溶液的a*值、b*值和C*值發(fā)生了不同程度的變化。ΔE代表色澤變化程度，80 MPa和120 MPa 處理組顏色變化程度最大。表明DHPM處理對(duì)于提高黑色素溶液的亮度等均具有一定的改善作用，這與Calligaris 等[26]對(duì)香蕉汁的研究結(jié)果類似。因此，DHPM處理能改善烏賊墨黑色素溶液的色澤。

表2 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素溶液色差的影響Table2 Effects of DHPM treatment on the color difference of melanin solution of Sepia pharaonis ink

2.6 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素溶解性的影響

DHPM處理前后烏賊墨黑色素溶解性的變化見(jiàn)表3，與其他動(dòng)物黑色素及人工合成多巴黑色素相同，對(duì)照組即酶解制備的虎斑烏賊墨黑色素也具有堿溶酸沉特性，不溶于大多數(shù)極性較低的有機(jī)溶劑和一些常見(jiàn)的無(wú)機(jī)溶劑，這與宋茹等[18]的報(bào)道相似。經(jīng)DHPM處理后，樣品在二甲基亞砜和0.05 mol·L-1氫氧化鈉溶劑中全溶，在去離子水、生理鹽水、丙三醇、丙酮和乙酸溶劑中隨著DHPM處理壓力的增大樣品溶解性逐漸增加，尤其在去離子水和生理鹽水中，其溶解性得到了很好的改善，這主要是因?yàn)镈HPM 所產(chǎn)生的高頻振動(dòng)、高速撞擊、強(qiáng)烈剪切等機(jī)械作用，使黑色素分子結(jié)構(gòu)得以伸展，使其內(nèi)部極性基團(tuán)暴露，其表面電荷增加，與水結(jié)合能力增強(qiáng)，溶解性得到改善[27]。

2.7 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素顆粒熱穩(wěn)定性的影響

熱穩(wěn)定性是影響烏賊墨黑色素在食品加工中應(yīng)用的關(guān)鍵因素，且熱變性與其空間構(gòu)象的改變密切相關(guān)[28]。由DSC 分析曲線及特征值(表4、圖5)可知，除120 MPa 處理組，其他處理組最大遷移點(diǎn)處與對(duì)照組的吸收峰接近，峰值溫度范圍為(114.00～122.20℃)，性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定。40、120、160和200 MPa 處理組的焓變值均減小，分別減小至5.57、0.45、4.34和2.75 J·g-1，80 MPa 處理組焓變值增加至6.38 J·g-1，表明不同DHPM處理壓力對(duì)虎斑烏賊墨黑色素的熱穩(wěn)定性有一定影響，但影響程度不同。120 MPa 處理組吸收峰呈現(xiàn)左移，其熱變性溫度為90.70℃，焓變值最小為0.45 J·g-1，此壓力對(duì)樣品熱穩(wěn)定性影響最大。

2.8 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素貯藏穩(wěn)定性的影響

DHPM處理前后樣品靜置貯藏30 d 后，觀察發(fā)現(xiàn)烏賊墨黑色素對(duì)照組樣品出現(xiàn)明顯分層，而DHPM處理后的樣品均無(wú)明顯分層。由表5可知，對(duì)照組貯藏30 d 后，其顆粒平均粒徑明顯增大，而DHPM處理組樣品的平均粒徑變化不大。上述結(jié)果表明，DHPM處理使烏賊墨黑色素具有良好的貯藏穩(wěn)定性，尤其120 MPa 處理組樣品平均粒徑變化最小，說(shuō)明該壓力下烏賊墨黑色素的貯藏穩(wěn)定性最好。

表3 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素溶解性的影響Table3 Effects of DHPM treatment on the solubility of melanin solution of Sepia pharaonis ink

表4 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素DSC 分析曲線特征值的影響Table4 Effects of DHPM treatment on the characteristic value of DSC analysis curve of melanin of Sepia pharaonisi ink

圖5 DHPM處理后烏賊墨黑色素DSC 分析曲線Fig.5 DSC analysis curves of melanin particles of Sepia pharaonis ink after DHPM pressure treatments

表5 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素貯藏穩(wěn)定性的影響Table5 Effects of DHPM treatment on storage stability of melanin of Sepia pharaonis ink

2.9 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素紅外光譜特征的影響

由圖6可知，DHPM處理前后樣品的紅外吸收峰主要集中在3 500～3 300、1 700～1 500、1 450～1 250 cm-1范圍內(nèi)，與對(duì)照組相比，經(jīng)DHPM處理后的樣品對(duì)紅外輻射能量的吸收強(qiáng)度存在結(jié)構(gòu)特征差異。DHPM處理后的樣品在1 700～1 500、1 250～750 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)了新的吸收峰，尤其200 MPa 處理組新峰的吸收強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說(shuō)明DHPM處理對(duì)黑色素表面基團(tuán)影響較大。

動(dòng)物源黑色素多屬于吲哚型，烏賊墨黑色素主要是以5，6-二羥基吲哚和5，6-二羥基吲哚酸為前體的真黑色素[6]，經(jīng)DHPM處理后，3 416.43 cm-1附近吸收的O-H和N-H 伸縮振動(dòng)、1 614.11 cm-1附近吸收的羧酸基團(tuán)COO-或芳環(huán)C=C或酰胺中C=O 振動(dòng)和1 400.23 cm-1附近吸收的COO-發(fā)生了變形振動(dòng)，新出現(xiàn)的峰位置發(fā)生了不同程度的偏移，峰吸收強(qiáng)度增大[29-30]，推測(cè)這可能是由于DHPM處理使得包裹在虎斑烏賊墨黑色素中的O-H、N-H 等基團(tuán)暴露，形成了較強(qiáng)的氫鍵[31]。

圖6 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素紅外吸收峰的影響Fig.6 Effects of DHPM treatment on infrared absorption peak of melanin of Sepia pharaonis ink

2.10 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖7-A可知，對(duì)照組烏賊墨黑色素是由單個(gè)呈圓形、大小不均一、表面清晰光滑的黑色素單體顆粒聚集而成，與李和生等[8]的研究結(jié)果一致。40、80 MPa處理組的黑色素聚集體開始解聚，顆粒結(jié)構(gòu)遭到DHPM 破壞使其表面比較粗糙，當(dāng)壓力增加至120 MPa時(shí)，黑色素體系由更致密均一的單體排列而成，同時(shí)顆粒平均粒徑變最小(100 nm 左右)。由圖7-E、F可知，當(dāng)壓力大于120 MPa時(shí)，烏賊墨黑色素顆粒又開始緩慢聚集，顆粒略變大。表明，DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素的微觀結(jié)構(gòu)有不同程度的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證了烏賊墨黑色素顆粒粒度的變化規(guī)律。

3 討論

烏賊墨黑色素是天然的海洋活性物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和安全性較高。近年來(lái)，隨著海洋頭足類烏賊加工副產(chǎn)物——烏賊墨逐年增加且得不到有效利用問(wèn)題突出，以及人們對(duì)黑色系食品的認(rèn)識(shí)和關(guān)注，天然黑色素的研究和開發(fā)日益增多，但由于烏賊墨黑色素的顆粒不均一和溶解性差等原因極大地限制了其在食品加工等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。因此，探尋操作安全、可工業(yè)化生產(chǎn)的口感細(xì)膩、可溶性烏賊墨黑色素的改性技術(shù)是研發(fā)高品質(zhì)食品原料的關(guān)鍵。郭欣等[32]在堿性條件下利用超聲降解技術(shù)制備了可溶性魷魚墨黑色素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可溶性魷魚墨黑色素平均粒度從17.34 μm 減小至1.47 μm，其作為一種天然色素和新型自由基清除劑，良好的溶解性很大程度上提高了機(jī)體的吸收利用率，但這種方法僅限于在堿性條件下，從食品產(chǎn)業(yè)實(shí)際應(yīng)用受限的角度來(lái)看，并未從根本上解決黑色素在食品添加中的開發(fā)利用瓶頸。而本試驗(yàn)采用蛋白酶對(duì)烏賊墨進(jìn)行酶解預(yù)處理，并結(jié)合DHPM技術(shù)制備的烏賊墨黑色素，不僅解決了上述方法中可溶墨黑色素僅在堿性條件下制備的限制，還較好地改善了其物理性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步為黑色素制備領(lǐng)域開辟了新途徑。

本研究采用DHPM技術(shù)在不同壓力下對(duì)虎斑烏賊墨黑色素進(jìn)行改性，發(fā)現(xiàn)120 MPa 處理后平均粒徑減至最小，為101.20 nm，是對(duì)照組平均粒徑的49.10%，同時(shí)改善了其在去離子水和生理鹽水中的溶解性，且改善后體系穩(wěn)定，克服了黑色素不溶于水的困難。伍敏暉等[33]研究DHPM技術(shù)對(duì)姜黃素納米乳液穩(wěn)定性的影響，利用不同壓力處理可以得到乳液粒徑小(196 nm)、品質(zhì)好、體系穩(wěn)定的姜黃素乳液；陳瓊玲等[34]采用高壓微射流法制備的白藜蘆醇納米脂質(zhì)體粒徑小(78.31 nm)、分布范圍窄，且體系物理性質(zhì)穩(wěn)定。所以，DHPM技術(shù)能有效改善食品原料性質(zhì)，具有清潔安全、可工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，能很好地應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域，而有關(guān)頭足類墨黑色素的研究仍然是未來(lái)研究的熱點(diǎn)之一[35]。

圖7 DHPM處理對(duì)虎斑烏賊墨黑色素微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Effects of DHPM treatment on microstructure of melanin of Sepia pharaonisi ink

綜上，DHPM技術(shù)的應(yīng)用不僅為大規(guī)模工業(yè)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)虎斑烏賊墨黑色素提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐，而且為更好地滿足廣大消費(fèi)者的需要和國(guó)內(nèi)市場(chǎng)需求，提高烏賊墨的綜合利用率和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，致力于烏賊墨黑色素抗氧化功能食品(墨汁面包制品、墨汁生鮮面等)、抗輻射護(hù)膚品、功能微膠囊、黑色系飲料和冰淇淋等產(chǎn)品的深度開發(fā)，讓更多含烏賊墨黑色素新產(chǎn)品投放市場(chǎng)提供了保障。

4 結(jié)論

本研究首次采用DHPM技術(shù)處理蛋白酶酶解制備的虎斑烏賊墨黑色素，確定最佳處理壓力并對(duì)其物理性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，DHPM處理大大改善了烏賊墨黑色素溶液的物理性質(zhì)，其中平均粒徑由原來(lái)的206.30 nm 減至最小為101.20 nm，粒徑分布更加集中、細(xì)微化，空間色度值的增大更好地提高了烏賊墨黑色素溶液的亮度，在去離子水和生理鹽水中的溶解性增加，在120 MPa 下熱變性溫度為90.70℃，焓變值為0.45 J·g-1，且該壓力下其貯藏穩(wěn)定性最好；同時(shí)DHPM處理使烏賊墨黑色素分子間形成了較強(qiáng)的氫鍵，黑色素體系中的單體排列更加致密均一。因此，采用DHPM 改性技術(shù)能很好地改善虎斑烏賊墨黑色素的物理性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)，為烏賊墨在食品加工開發(fā)中的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)和研究方向。