胡玲玲，李磊，周穎娟

（珠海市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東 珠海 519000）

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏癥是常見(jiàn)的遺傳性酶缺乏疾病，為X連鎖不完全顯性遺傳病，我國(guó)各地區(qū)發(fā)病率有較大差異，高發(fā)區(qū)集中在長(zhǎng)江流域以南[1]。致病基因位于Xq28[2]，由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子組成，因女性有兩個(gè)X染色體，故有兩個(gè)G6PD基因，女性的基因型分為正常，缺乏雜合子以及缺乏純合子，因兩個(gè)X染色全部缺陷的可能性較小，故女性G6PD缺乏的主要形式是以雜合子存在。G6PD缺乏雜合子酶活性變化范圍較大，可以表現(xiàn)為正常、中度缺乏和重度缺乏，而男性半合子G6PD缺乏活性一般呈顯著性缺乏，嚴(yán)重者可導(dǎo)致新生兒期核黃疸，引起死亡或永久性神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[3]?，F(xiàn)階段各實(shí)驗(yàn)室用于G6PD缺乏篩查的主要方法為高鐵血紅蛋白還原法和熒光斑點(diǎn)法。本研究收集2019年5月-9月期間前來(lái)本院進(jìn)行孕前檢查的2096份女性標(biāo)本，應(yīng)用上述兩種方法作為初篩試驗(yàn)，并對(duì)所有樣本應(yīng)用高分辨熔解曲線法作為G6PD缺乏癥的確證實(shí)驗(yàn)，以期評(píng)價(jià)上述兩種常用初篩方法在G6PD缺乏女性雜合子篩查中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 2019年5月-9月期間前來(lái)珠海市婦幼保健院進(jìn)行孕檢的珠海籍女性2096人，年齡為22-40周歲，血紅蛋白檢測(cè)值均在115-150 g/L。采用EDTA抗凝真空管抽血3 mL。

1.2 方法

1.2.1 G6PD熒光斑點(diǎn)法 將血滴入濾紙片形成血斑待干燥，用打孔器在血片上打下一直徑3 mm的血片于反應(yīng)試管中，加入反應(yīng)混合液100 μL，置37oC孵育箱中10 min，取約2.5 μL血斑混合反應(yīng)液滴于濾紙上，用風(fēng)筒吹干后置于紫外燈下觀察熒光情況。結(jié)果判斷：熒光強(qiáng)度++時(shí)，熒光斑點(diǎn)光亮，判斷為G6PD正常；熒光強(qiáng)度+--時(shí)，為G6PD缺乏陽(yáng)性，判斷為輕-中度缺乏；斑點(diǎn)暗淡表示無(wú)熒光，判斷為重度缺乏。

1.2.2 MHB-RT法 按第3版《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》方法進(jìn)行試劑配制和操作，試劑為1.25%亞硝酸鈉葡萄糖、0.0004 mol/L美蘭溶液。結(jié)果判斷：高鐵血紅蛋白還原率＜75%為缺乏陽(yáng)性，≥75%為正常。

1.2.3 熒光PCR熔解曲線法 采用廈門(mén)致善生物技術(shù)有限公司的G6PD基因檢測(cè)試劑盒，可檢出中國(guó)人群常見(jiàn)的16種突變類(lèi)型，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行率的比較。采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MHB-RT法和熒光斑點(diǎn)法檢出率 對(duì)2096例孕檢女性進(jìn)行G6PD篩查檢測(cè)，女性陽(yáng)性檢出率為12.36%。熒光斑點(diǎn)法篩查時(shí)，陰性標(biāo)本2040例，陽(yáng)性標(biāo)本56例，高鐵血紅蛋白還原率≥75%的樣本有1852份（即陰性結(jié)果有1852份），高鐵血紅蛋白還原率＜75%的標(biāo)本有244份（即陽(yáng)性結(jié)果有244份）；兩種方法陰性符合率為90.8%。其中熒光斑點(diǎn)為中到重度缺乏的樣本用MHB-RT法可100%檢出。見(jiàn)表1。

2.2 MHB-RT法與熒光PCR法 采用高分辨熒光熔解曲線法對(duì)MHB-RT陽(yáng)性樣本進(jìn)行批量檢測(cè)，其中222例基因確診陽(yáng)性，22例為正常，假陽(yáng)性率為1.2%，余1852例MHB-RT陰性樣本有37例確診為G6PD缺乏患者，假陰性率14.3%，檢測(cè)靈敏度為85.7%（222/259），特異度為98.8%（1815/1837）。基因突變位點(diǎn)分別為：c.1376G＞T 102例，c.1388G＞A 93例，c.95A＞G 34例，c.1024G＞T 19例，c.871G＞A 7例，c.392G＞T 2例，c.1388 G＞A/95A＞G 1例，c.1388G＞A/1024 G＞T 1例。MHB-RT法與高分辨熒光熔解曲線法檢測(cè)結(jié)果比較，其檢出率經(jīng)χ2檢驗(yàn)可知χ2=0.508，P=0.476，說(shuō)明兩種方法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其吻合性經(jīng)Kappa系數(shù)檢驗(yàn)可知K=0.916，P=0.001，說(shuō)明兩種診斷方法的吻合度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表1 MHB-RT和熒光斑點(diǎn)法檢測(cè)結(jié)果（例）

表2 MHB-RT和高分辨熒光熔解曲線法檢測(cè)結(jié)果（例）

2.3 熒光斑點(diǎn)法與熒光PCR法 在熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)陰性的2040例樣本中有212例為基因確診陽(yáng)性，假陰性率為81.9%，56例樣本中有9例假陽(yáng)性，假陽(yáng)性率為0.5%。檢測(cè)靈敏度為18.1%（47/259），特異度為99.5%（1828/1837）。熒光斑點(diǎn)法與高分辨熒光熔解曲線法檢測(cè)結(jié)果比較，其檢出率經(jīng)χ2檢驗(yàn)可知χ2=141.451，P=0.000，說(shuō)明兩種方法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其吻合性經(jīng)Kappa系數(shù)檢驗(yàn)可知K=0.266，P=0.000，說(shuō)明兩種診斷方法的吻合度較差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 熒光斑點(diǎn)法和高分辨熒光熔解曲線法檢測(cè)結(jié)果（例）

2.4 熒光斑點(diǎn)與MHB-RT法 G6PD熒光斑點(diǎn)活性與MH-RT檢測(cè)結(jié)果比較，檢出率經(jīng)χ2檢驗(yàn)可知χ2=10.044，P=0.002，說(shuō)明兩種方法比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因?yàn)闄z測(cè)方法敏感性的不同，兩方法對(duì)女性雜合子檢出率存在差異。

3 討論

G6PD缺乏癥由于無(wú)法根治，只能對(duì)癥治療及預(yù)防發(fā)病，故在人群中特別是產(chǎn)檢和婚檢中進(jìn)行快速有效的篩查顯得尤其重要。本文主要是探究熒光斑點(diǎn)法和高鐵血紅蛋白還原法兩種初篩試驗(yàn)在女性雜合子攜帶者中的優(yōu)越性差異。因男性半合子和女性純合子G6PD缺乏時(shí)，其酶活性常常為重癥缺乏，熒光斑點(diǎn)法和高鐵血紅蛋白還原法對(duì)于此類(lèi)缺乏者篩查敏感性均為100%，兩種方法無(wú)明顯差異。對(duì)于女性雜合子的篩查，MHB-RT法有著較高的靈敏度，與G6PD確診檢測(cè)方法熒光PCR法相比檢出率無(wú)明顯差異，且與確診方法吻合度較高。而熒光斑點(diǎn)檢測(cè)方法假陰性率較高，漏診情況嚴(yán)重，其檢出率與確診方法相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且吻合度較差，不符合初篩試驗(yàn)應(yīng)具有較高靈敏度的要求，故MHB-RT法對(duì)女性雜合子G6PD缺陷的初篩效果明顯優(yōu)于熒光斑點(diǎn)法。我們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在合適的底物濃度和反應(yīng)溫度下，反應(yīng)時(shí)間更為重要[4]。這是由于部分屬于輕、中度缺陷的雜合子患者紅細(xì)胞中NADPH生成不足，硝基四氮唑藍(lán)不能充分還原。在篩查過(guò)程中易于將這部分屬于輕、中度缺陷的女性雜合子漏檢。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)G6PD篩查的樣本最好能在24 h內(nèi)檢測(cè)，必要時(shí)洗滌紅細(xì)胞以排除白細(xì)胞和血小板的影響。據(jù)報(bào)道，c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.95A＞G和c.871G＞A幾個(gè)熱點(diǎn)突變，檢出率可達(dá)70%，本研究中，上述四種突變點(diǎn)檢出率達(dá)到91.1%，略高于文獻(xiàn)報(bào)道檢出率[5]，本地區(qū)突變以1376G＞T為主，為本地區(qū)女性攜帶者中的突變熱點(diǎn)。

熒光斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)需要長(zhǎng)波紫外光燈及氧化型谷胱甘肽（GSSG），判斷結(jié)果受主觀因素影響大[6-7]，MHB-RT法成本低，方法簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定，應(yīng)用MHB-RT法檢測(cè)女性G6PD缺陷，能更客觀更準(zhǔn)確篩查G6PD缺陷癥，尤其對(duì)女性雜合子的早期篩查、早期診斷、早期預(yù)防提供可靠的診斷依據(jù)，減少漏診和誤診。在疾病高發(fā)地區(qū)可開(kāi)展G6PD缺乏癥的產(chǎn)前酶活性篩查，為育齡人群提供G6PD缺乏癥的宣傳教育和遺傳咨詢[8]。特別是在基層醫(yī)院中，由于儀器設(shè)備等限制，MHB-RT法不失為快速篩查G6PD缺陷癥的好方法[8]。本研究中，由于樣本均為女性，所以對(duì)本地區(qū)的G6PD缺乏率仍需更大樣本量待進(jìn)一步研究。