黎桂玲，劉 科，楊 林，黎雄才，鄺少松，王 剛

（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 佛山 528248）

【研究意義】隨著生命科學(xué)的發(fā)展，輔助生殖技術(shù)（Assisted Reproductive Technology，ART）［1］和基因編輯技術(shù)扮演著越來(lái)越重要的角色。小鼠作為人類疾病動(dòng)物模型，對(duì)一些疾病研究具有重要意義，如阿爾茨海默?。?］、帕金森病［3］等。利用小鼠的輔助生殖技術(shù)來(lái)改善甚至增強(qiáng)小鼠的機(jī)能和貢獻(xiàn)力，成為小鼠研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在輔助生殖技術(shù)的研究中，已有對(duì)精液保存、卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)、人工授精、體外受精、胚胎移植和胚胎體外培養(yǎng)等研究［1,4-5］，但在體外受精這一研究中缺乏精子數(shù)量對(duì)小鼠的體外受精和胚胎早期發(fā)育的影響研究。精液分析是評(píng)估雄性動(dòng)物生育能力的最基本檢測(cè)項(xiàng)目，精子計(jì)數(shù)更是其中重要的指標(biāo)之一［6］。相關(guān)研究表明，精液常規(guī)分析對(duì)預(yù)測(cè)精子結(jié)構(gòu)和功能完整性的有效性達(dá)38.13%［7］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于精液對(duì)輔助生殖技術(shù)的研究較多，如精液保存的條件及體外受精條件的探討，但從精子數(shù)量或密度角度對(duì)體外受精及胚胎體外發(fā)育的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)通過(guò)利用不同精子數(shù)量對(duì)小鼠體外受精及胚胎早期體外發(fā)育影響的研究，進(jìn)一步完善小鼠體外受精技術(shù)，促進(jìn)輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，從而提高小鼠的繁育工作，為人類疾病動(dòng)物模型的發(fā)展提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)C57BL/6雌鼠（4周齡，60只）、雄鼠（9周齡，16只），均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2018-0002。

主要儀器：體視顯微鏡（ZSA302T，中國(guó)）、倒置顯微鏡（MI 12，中國(guó)）、二氧化碳培養(yǎng)箱（熱電3111，美國(guó)）、分體式恒溫加熱臺(tái)（JR-3020，中國(guó)）、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司）

主要試劑：注射用血促性素（PMSG）、注射用絨促性素（hCG），均購(gòu)自寧波第二激素廠；人輸卵管培養(yǎng)液（HTF），配方見(jiàn)表1；M16胚胎培養(yǎng)基、礦物油，均購(gòu)自Sigma公司。

表1 人輸卵管培養(yǎng)液（HTF）配方Table 1 Formula of human fallopian tube culture fluid（HTF）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 飼養(yǎng)方法 C57BL/6雌雄小鼠均飼養(yǎng)在SPF級(jí)屏障設(shè)施環(huán)境中，溫度控制在20～26℃，相對(duì)濕度為40%～70%。光照周期為10 h明/14 h暗，換氣次數(shù)大于20次/ h。飲用水均經(jīng)過(guò)高溫滅菌，紫外照射消毒。飼料為廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的無(wú)菌繁殖鼠料，小鼠自由飲食、飲水?；\具與飼料按2次/周進(jìn)行更換，均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的高溫蒸汽滅菌消毒，進(jìn)出屏障設(shè)施均嚴(yán)格遵守相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。動(dòng)物飼養(yǎng)及試驗(yàn)均在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障設(shè)施內(nèi)進(jìn)行。本試驗(yàn)經(jīng)廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（IACUC審查號(hào)：B201712-21），嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2.2 超數(shù)排卵 隨機(jī)選取60只4周齡C57BL/6雌鼠，注射PMSG（10 IU/只），并于46～48 h 后注射hCG（10 IU/只）進(jìn)行超數(shù)排卵，15 h后頸椎脫臼處死，從輸卵管膨大部獲取卵母細(xì)胞團(tuán)放置于提前準(zhǔn)備好含HTF的受精皿（含2個(gè)160 μL HTF滴和2個(gè)50 μL HTF滴，下同）內(nèi)。

1.2.3 精子計(jì)數(shù) 隨機(jī)選取16只9周齡C57BL/6雄鼠，與欲將淘汰的雌鼠合籠試配3 d，取出雌鼠，單放雄鼠3 d后頸椎脫臼處死后，附睪尾獲取的精子放入提前準(zhǔn)備好的含HTF精子皿（含200 μL HTF滴，下同）內(nèi)，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1 h。用移液槍將獲能后的精子從精子滴邊緣分別吸取1、3、5、10、15、20 μL精子溶液滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行精子計(jì)數(shù)［8-10］。

1.2.4 體外受精 將60只各裝有兩個(gè)卵丘卵母細(xì)胞團(tuán)的受精皿隨機(jī)分為6組，每組10個(gè)受精皿。從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出精子皿，用移液槍從精子滴邊緣分別吸取1、3、5、10、15、20 μL精液置于6個(gè)試驗(yàn)組中，記錄精子計(jì)數(shù)后，將受精皿置于37℃、5% CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.5 胚胎的體外培養(yǎng)和胚胎收集 精卵共孵育24 h后，從培養(yǎng)箱取出受精皿，撿出未受精的卵母細(xì)胞、1-細(xì)胞合子、2-細(xì)胞胚胎及畸形胚胎，放于受精滴旁邊的50 μL HTF滴中洗凈后，置于提前準(zhǔn)備并已孵育2 h的M16培養(yǎng)滴中。準(zhǔn)確計(jì)數(shù)卵母細(xì)胞、1-細(xì)胞合子、2-細(xì)胞胚胎及畸形胚胎，并計(jì)算受精率、2-細(xì)胞胚胎發(fā)育率和畸形率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及差異顯著性分析，組間差異用Duncan's多重范圍檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同精子數(shù)量對(duì)體外受精率的影響

從不同精子溶液體積的精子數(shù)量（表2）可以看出，在精子外環(huán)境相同的情況下，不同精子溶液體積的精子數(shù)量不同。通過(guò)同批次超排后取得的卵母細(xì)胞團(tuán)中加入不同精子數(shù)量的精子溶液后發(fā)現(xiàn)，其體外受精率隨精子數(shù)量的增加而出現(xiàn)一定的降低趨勢(shì)，且差異較大。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，精子數(shù)量為1.23（±0.31）×106個(gè)/mL和2.03（±0.35）×106個(gè)/mL的體外受精率較高，分別為95.17%、94.29%，但差異不顯著，與精子數(shù)量 為 0.25（±0.23）×106、3.95（±0.33）×106個(gè)/mL的體外受精率差異顯著，而極顯著高于精子數(shù)量 為 6.50（±0.76）×106、9.88（±0.52）×106個(gè)/mL的體外受精率。

表2 不同精子數(shù)量與體外受精率的影響Table 2 Numbers of sperm and in vitro fertilization rates with different sperm solution volumes

2.2 不同精子數(shù)量對(duì)胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的影響

小鼠體外受精過(guò)程中，不同精子數(shù)量不僅使體外受精率有較大差異，也會(huì)使胚胎的發(fā)育受到一定影響。體外受精24 h后，正常2-細(xì)胞胚胎隨精子數(shù)量的不同存在一定差異（圖1A）。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，精子數(shù)量為1.23（±0.31）×106、2.03（±0.35）×106個(gè)/mL時(shí)，2-細(xì)胞胚胎發(fā)育率較好，均顯著高于精子數(shù)量為（6.50±0.76）×106個(gè)/mL的情況，均極顯著高于精子數(shù)量為9.88（±0.52）×106個(gè)/mL的情況。同時(shí)，精子數(shù)量數(shù) 為 3.95（±0.33）×106、6.50（±0.76）×106個(gè)/mL的2-細(xì)胞胚胎發(fā)育率均極顯著高于精子計(jì)數(shù)為9.88（±0.52）×106個(gè)/mL的情況。

在胚胎體外發(fā)育過(guò)程中，不同精子數(shù)量導(dǎo)致胚胎異常發(fā)育的差異較大（圖1B）。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，精子數(shù)量為9.88（±0.52）×106個(gè)/mL時(shí)，胚胎異常發(fā)育的概率較大，與精子數(shù)量分別為0.25（±0.23）×106、1.23（±0.31）×106、2.03（±0.35）×106、3.95（±0.33）×106、6.50（±0.76）×106個(gè)/mL的情況相比，差異均極顯著。

圖1 不同精子數(shù)量對(duì)胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的影響Fig. 1 Effects of different sperm counts on the growth and development of embryos

3 討論

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是最早應(yīng)用于精子計(jì)數(shù)的計(jì)數(shù)池之一，也是目前WHO推薦使用的精子計(jì)數(shù)工具，目前仍被廣泛應(yīng)用［9］。雖然血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池深度為0.1 mm，精子容易互相重疊，但使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板時(shí)，精液標(biāo)本需要稀釋，因此，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的結(jié)果更接近于真實(shí)值。Johnson等［10］認(rèn)為血細(xì)胞計(jì)數(shù)板可作為精液常規(guī)分析的“金標(biāo)準(zhǔn)引”。因此，本研究在對(duì)小鼠精液的常規(guī)分析中利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行精子計(jì)數(shù)是常見(jiàn)且較為準(zhǔn)確的方法。本試驗(yàn)中精液獲能1 h后，活力較好的精子會(huì)逐漸向精子滴四周邊緣游去，精子滴中間留下的精子活力較差或是死精。隨著精子溶液體積的增加精子數(shù)量也不斷增加，且具有一定的差異性。

ART是利用人工的方法使精子和卵子相互結(jié)合的技術(shù)，包括精液保存、卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)、人工授精、體外受精、胚胎移植和胚胎體外培養(yǎng)等技術(shù)［11-12］。ART的不斷完善在一定程度上對(duì)動(dòng)物及人類生殖過(guò)程、遺傳病機(jī)制、干細(xì)胞定向分化［13］等研究課題提供了基礎(chǔ)；同時(shí)，ART的臨床應(yīng)用為這些課題的深入研究積累經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)造發(fā)展條件，推動(dòng)醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)的不斷發(fā)展進(jìn)步［14］。體外受精技術(shù)是ART重要的組成部分，將從母體取出的卵細(xì)胞置于培養(yǎng)皿內(nèi)，加入經(jīng)優(yōu)選誘導(dǎo)獲能處理的精子，使精卵合適的條件下進(jìn)行體外受精，獲取一定數(shù)量?jī)?yōu)質(zhì)胚胎的技術(shù)。在相關(guān)小鼠體外受精技術(shù)研究中，遺傳背景［15-16］、品系［17-19］、培養(yǎng)液成分［20-21］、精子與卵母細(xì)胞質(zhì)量等相關(guān)研究都較為成熟，但對(duì)精子計(jì)數(shù)的研究較少。通過(guò)對(duì)不同精子計(jì)數(shù)進(jìn)行體外受精實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)精子數(shù)量為1.23（±0.31）×106～2.03（±0.35）×106個(gè)/mL時(shí)，小鼠的體外受精率較高，隨著精子數(shù)量的增加，體外受精率呈現(xiàn)一定的下降趨勢(shì)，這一結(jié)論與Fraser等［22］的研究結(jié)果相似。在本試驗(yàn)中小鼠的體外受精率隨精子數(shù)量的增加而降低，該趨勢(shì)的出現(xiàn)與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和共存環(huán)境有關(guān)。在一定范圍內(nèi)，HTF培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)可以促使精子與卵母細(xì)胞發(fā)生受精作用形成受精卵，進(jìn)一步發(fā)育成胚胎。隨著精子數(shù)量的增加，精子間的“競(jìng)爭(zhēng)”與精子與卵母細(xì)胞的“競(jìng)爭(zhēng)”都會(huì)導(dǎo)致其活力的下降，從而使受精率降低；同時(shí)，過(guò)多的精子與卵母細(xì)胞的代謝產(chǎn)物在一定程度上也會(huì)導(dǎo)致受精率降低，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎的正常發(fā)育。

正常情況下，有些精子5 min內(nèi)就能到達(dá)輸卵管壺腹部［23］，但并不具備受精能力，需要在輸卵管內(nèi)進(jìn)行獲能。HTF液為輸卵管培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和水分的環(huán)境下，所處環(huán)境和理化因子與雌鼠輸卵管內(nèi)環(huán)境相似。精子首先穿過(guò)卵丘團(tuán)和透明帶，發(fā)生頂體反應(yīng)后方可與卵母細(xì)胞膜融合完成受精。體外受精后胚胎在11～18 h完成DNA復(fù)制，17～20 h后進(jìn)行卵裂［24］，在受精24～27 h后胚胎能正常發(fā)育到2-細(xì)胞中期［25］。因此，精子需在HTF液中培養(yǎng)1 h獲能后方可進(jìn)行體外受精試驗(yàn)，體外培養(yǎng)24 h后可正常發(fā)育到2-細(xì)胞。

相關(guān)研究表明，胚胎的發(fā)育不僅與排卵率、生存空間、胎兒先天性缺陷、生殖激素、子宮感染及營(yíng)養(yǎng)水平等有關(guān)，同時(shí)還受品種、遺傳、胎次和環(huán)境條件的影響［26］。37℃、5% CO2、飽和水分的環(huán)境下發(fā)現(xiàn)，不同數(shù)量的精子參與體外受精，在經(jīng)過(guò)24 h后胚胎發(fā)育正常至2-細(xì)胞胚胎的概率有較大差異。精子數(shù)量為0.25（±0.32）×106～3.95（±0.33）×106個(gè)/mL時(shí)，正常發(fā)育到2-細(xì)胞胚胎的概率差異不顯著，但精子計(jì)數(shù)為1.23（±0.31）×106～2.03（±0.35）×106個(gè)/mL時(shí)胚胎受精率及2-細(xì)胞胚胎發(fā)育率較好；隨著精子數(shù)量增加到6.50（±0.76）×106個(gè)/mL時(shí)，2-細(xì)胞胚胎率顯著性降低；精子計(jì)數(shù)增加到9.88（±0.52）×106個(gè)/mL時(shí)，胚胎正常發(fā)育情況較差，且畸形胚胎較多。該現(xiàn)象表明未受精的精子在一定程度上成為了胚胎發(fā)育的“競(jìng)爭(zhēng)者”，不僅與胚胎爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與生存環(huán)境，其代謝產(chǎn)物也會(huì)影響胚胎的正常發(fā)育，進(jìn)一步說(shuō)明胚胎的發(fā)育與所處的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境密不可分。不利的胚胎營(yíng)養(yǎng)環(huán)境可以阻礙胚胎發(fā)育，影響胚胎代謝，導(dǎo)致胚胎發(fā)生慢性疾病甚至停止發(fā)育，甚至?xí)黾觿?dòng)物出生后代謝性疾病的發(fā)生率［27］。由此看來(lái)，精子數(shù)量不僅對(duì)小鼠體外受精率有影響，而且也會(huì)影響小鼠胚胎的正常發(fā)育。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)小鼠精子進(jìn)行計(jì)數(shù)，利用不同精子數(shù)量參與小鼠體外受精并進(jìn)行體外培養(yǎng)，對(duì)體外受精率和正常發(fā)育到2-細(xì)胞胚胎的概率比較分析得出，精子數(shù)量為1.23（±0.31）×106～2.03（±0.35）×106個(gè)/mL時(shí)，小鼠的體外受精和胚胎體外培養(yǎng)發(fā)育較好，從而獲得較多優(yōu)質(zhì)的胚胎。本試驗(yàn)結(jié)果豐富了體外受精技術(shù)，促使小鼠的輔助生殖技術(shù)得到進(jìn)一步完善，同時(shí)對(duì)小鼠的輔助生殖技術(shù)、基因工程等研究提供了一定的參考。