任德忠，叢方地,,通信作者，王曉紅，張蒙，王鑫鑫，張樹林，羅巍

（1.天津農(nóng)學院 基礎(chǔ)科學學院，天津 300384；2.天津市水產(chǎn)生態(tài)與養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

乙酸正戊酯是一種具有香蕉氣味的無色透明液體，是重要的香料和專用有機溶劑，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、涂料、印染等領(lǐng)域，在國內(nèi)外有廣闊的需求市場[1]?，F(xiàn)有的酯合成工藝中，使用的催化劑多為雜多酸、負載雜多酸、固體超強酸及無機化合物[2]，且多在高溫、強酸或微波條件下催化反應(yīng)，難以避免高能耗、酸堿腐蝕、重污染等問題[3]。為克服這些不足，人們正探索生物催化合成方法，如酶催化，具有反應(yīng)條件溫和、綠色、高效、低碳、高選擇性等諸多優(yōu)點[4-5]。但酶制劑價格通常較貴，使用成本高。然而，酶固定化后不但催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率有很大提高[6]，而且也可提高酶的穩(wěn)定性[7]。此外，使用固定化酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的分離和純化更便利[8]。在前期研究的基礎(chǔ)上[9-15]，本研究將假單胞菌脂肪酶Pseudomonas cepacialipase（PCL）固定在脫脂棉纖維上，并與反應(yīng)裝置一起制成生物反應(yīng)器，催化正戊醇與乙酸乙烯酯發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)合成乙酸正戊酯，取得較好的催化效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

儀器：恒溫搖床（HZQ-X）、氣相色譜儀（Echrom A90）、電子天平（FA2104A）、移液槍（200 μL、1 000 μL）、恒溫水浴鍋（HH-3）。試劑：假單胞菌脂肪酶（PCL，33 U/mg）酶粉購于Sigma Co., Ltd.公司，正戊醇、乙酸乙烯酯、無水乙醇、正己烷和其他有機溶劑皆為分析純。醫(yī)用脫脂棉購于市場，參考相關(guān)研究[10]，取10 g脫脂棉置于燒杯中，加入無水乙醇直至完全浸沒脫脂棉，用保鮮膜封口，室溫下浸泡2 d。用鑷子將脫脂棉取出放入干凈的燒杯中，再次加入無水乙醇浸泡1 d。然后用鑷子將脫脂棉取出放入干凈的燒杯中，用多層紗布將燒杯口封好，室溫下自然晾干，使用時用鑷子將其拉至蓬松。

1.2 PCL在脫脂棉上的固定化

參考參考文獻[9]，稱取10 mg PCL酶粉，放入容積為10 mL的柱形玻璃瓶中，加入0.2 mL蒸餾水，輕輕搖晃使酶粉溶于水。稱取10 mg處理過的脫脂棉，加入玻璃瓶中，讓脫脂棉充分吸附酶溶液。然后將玻璃瓶敞口置于搖床中，在37 ℃、160 r/min條件下保持7 h以上[10]，用鑷子將瓶內(nèi)脫脂棉拉至蓬松狀態(tài)，得固定化酶脫脂棉-PCL，連同柱形瓶一起形成脫脂棉-PCL瓶型反應(yīng)器，見圖1（a）。

圖1 脫脂棉-PCL瓶型（a）和管式（b）反應(yīng)器

稱取10 mg PCL酶粉放在表面皿中心，加0.2 mL蒸餾水充分溶解酶粉，稱取10 mg處理過的脫脂棉放置于培養(yǎng)皿上，使其充分吸附酶溶液，然后將表面皿放置在恒溫箱中，在37 ℃條件下保持90 min以上，揮發(fā)掉水分，用鑷子將脫脂棉撕拉至蓬松，得脫脂棉-PCL，可放入10 mL的柱形玻璃瓶或滴定管中使用。

1.3 酶催化合成乙酸正戊酯反應(yīng)

分別在含有脫脂棉-PCL和PCL酶粉的10 mL柱形玻璃瓶中加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，蓋上瓶蓋并用保鮮膜密封，在37 ℃、160 r/min條件下催化反應(yīng)。每個反應(yīng)體系中的PCL酶粉質(zhì)量都是10 mg。另外，按照上述方法配制同樣的兩個反應(yīng)體系，置于37 ℃恒溫水浴鍋中靜置反應(yīng)。以上所有的反應(yīng)體系每2 h進行取樣分析。

另在 6個脫脂棉-PCL反應(yīng)器中，分別加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，蓋蓋并密封，靜置在不同溫度下，催化反應(yīng)24 h，取樣分析。在6個脫脂棉-PCL反應(yīng)器中，分別加入1 mL正戊醇和2-7 mL的乙酸乙烯酯，蓋蓋并密封，靜置在 37 ℃條件下催化反應(yīng) 24 h，取樣分析。在 6個脫脂棉-PCL反應(yīng)器中，分別加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，再分別加入1-6 mL體積不等的正己烷，蓋蓋并密封，靜置在37 ℃下催化反應(yīng)24 h，取樣分析。

1.4 脫脂棉-PCL瓶型反應(yīng)器重復(fù)催化反應(yīng)

在1個脫脂棉-PCL反應(yīng)器中，加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，蓋蓋并密封，靜置在37 ℃下催化反應(yīng)24 h，取樣分析。然后，將反應(yīng)液傾出，并用少量正己烷清洗3次，敞口放置15 min，使正己烷揮發(fā)完全。重新向此反應(yīng)器中加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，蓋蓋并密封，靜置在37 ℃下催化反應(yīng)24 h，取樣分析。如此循環(huán)操作6次。

1.5 不同種脫脂棉-PCL催化合成乙酸正戊酯

在脫脂棉-PCL瓶型反應(yīng)器中，加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，蓋蓋并密封，恒溫37 ℃水浴靜置催化反應(yīng)，并按時取樣分析。另在10 mL柱形玻璃瓶中，加入在表面皿中固定而得的脫脂棉-PCL（脫脂棉10 mg），如上加入相應(yīng)量的反應(yīng)液，并在同樣條件下催化反應(yīng)后取樣分析。

1.6 脫脂棉-PCL管式反應(yīng)器中催化反應(yīng)

將表面皿中固定而得的脫脂棉-PCL（脫脂棉50 mg）撕拉蓬松，裝入酸式滴定管中構(gòu)成脫脂棉-PCL管式反應(yīng)器，見圖1（b），將正戊醇與乙酸乙烯酯按體積比1∶2混合均勻后加入到酸式滴定管中，待脫脂棉與溶液充分接觸后開始計時，1 h后，打開滴定管閥門，將與棉花接觸的反應(yīng)液放出，關(guān)閉閥門，對流出液取樣分析。此后，逐漸延長催化反應(yīng)時間，并放出反應(yīng)液，取樣分析。

1.7 樣品色譜分析方法

每次分析，取20 μL反應(yīng)液，用1 mL正己烷稀釋，0.25 μm濾膜過濾，進行GC分析，色譜條件為：氮氣（0.4 MPa，分流比 1∶1），65 ℃，保留3 min；15 ℃/min，130 ℃，保留1.5 min。進樣和檢測溫度分別為280和300 ℃。正戊醇和乙酸正戊酯的保留時間分別為2.6、4.6 min。根據(jù)正戊醇和乙酸正戊酯的峰面積計算底物的摩爾轉(zhuǎn)化率[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖動和靜置條件下的酶促反應(yīng)

將脫脂棉-PCL瓶型反應(yīng)器中的脫脂棉撕成蓬松，可盡可能增大其比表面積[11]，進行催化反應(yīng)時，反應(yīng)液與酶的接觸面得以增大，以提高酶催化反應(yīng)的效率。在37 ℃、分別靜置和搖動條件下，脫脂棉-PCL與PCL酶粉催化正戊醇和乙酸乙烯酯反應(yīng)生成乙酸正戊酯。由圖2可見，相對于PCL酶粉，脫脂棉-PCL轉(zhuǎn)化底物的能力明顯較高，2 h后，脫脂棉-PCL催化轉(zhuǎn)化底物的能力約為PCL酶粉的3倍。搖動和靜置條件相比較，無論酶粉還是固定化酶，在兩種條件下的轉(zhuǎn)化能力相近，這可能是由于脫脂棉-PCL固定化酶有較大比表面積的原因。因此，可以選在靜置條件下進行酶催化反應(yīng)，以達到更低碳的效果。

圖2 37 ℃下的酶促反應(yīng)動力學

2.2 溫度對脫脂棉-PCL催化效果的影響

酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度對酶的構(gòu)象有較大影響，以致影響其催化作用[16]。在靜置和不同溫度下，脫脂棉-PCL瓶型反應(yīng)器催化正戊醇和乙酸乙烯酯反應(yīng)24 h的效果見圖3。室溫（25 ℃）下，反應(yīng)體系的轉(zhuǎn)化率即可達 97%?？梢?，此反應(yīng)器可在靜置和常溫下有效催化反應(yīng)，達到更低碳催化的效果。

圖3 脫脂棉-PCL瓶型反應(yīng)器中反應(yīng)轉(zhuǎn)化率

2.3 反應(yīng)底物比和溶劑用量對脫脂棉-PCL催化效果的影響

在酶促反應(yīng)中，當某一底物濃度固定，反應(yīng)受底物摩爾比的影響十分顯著[17]。在6個脫脂棉-PCL反應(yīng)器中分別加入 2-7 mL乙酸乙烯酯，在37 ℃、靜置條件下，催化反應(yīng)24 h，得到如圖4所示結(jié)果。加入不同量的乙酸乙烯酯，酯轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)較小的波動，波動幅度不超過1%，都在99%以上。基于此，在正戊醇用量為1 mL時，乙酸乙烯酯的用量取最小體積，即2 mL。

圖4 酰化試劑和溶劑對酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響

醇類物質(zhì)有一定的粘稠性[18]，在反應(yīng)中有可能影響反應(yīng)器的酶促轉(zhuǎn)酯能力。在 6個脫脂棉-PCL瓶型反應(yīng)器中，加入1 mL正戊醇和2 mL乙酸乙烯酯，再分別加入1-6 mL的正己烷。在37 ℃、靜置條件下，反應(yīng)24 h，結(jié)果如圖4。可見，加入正己烷的量對轉(zhuǎn)化效率的影響并不大，轉(zhuǎn)化率幾乎接近100%，原因可能是正戊醇在2 mL乙酸乙酯中可以充分地被分散，其粘稠度已經(jīng)不再對轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生較大影響，無需再向反應(yīng)體系中加入小分子溶劑進行稀釋。

2.4 脫脂棉-PCL瓶型反應(yīng)器活性的穩(wěn)定性

固定化酶催化活性的穩(wěn)定性對于其應(yīng)用于催化反應(yīng)非常重要[19]，為驗證脫脂棉-PCL催化活性的穩(wěn)定性，脂棉-PCL被重復(fù)使用于6次催化反應(yīng)，每次催化24 h，結(jié)果見圖5（a）。參考文獻相關(guān)研究[20]，以第一次催化反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化率作為固定化酶在非水相條件下的初始活力，即 99.4%。以第六次催化反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化率作為衰減后的酶活力，也就是再重復(fù)利用5次后的酶活力，即77.4%。那么，脫脂棉-PCL的反應(yīng)活力衰減率為（99.4%-77.4%）÷（24 h×5）＝0.18%/h。相對于類似的催化反應(yīng)[21]，此脫脂棉-PCL催化活性的穩(wěn)定性不夠理想，但比PCL酶粉的催化效果好[10]。盡管如此，重復(fù)利用5次的脫脂棉-PCL可通過重復(fù)固定化操作而活化，活化后其催化反應(yīng)24 h后，轉(zhuǎn)化率達90.0%，見圖5（b）。雖然其催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率沒有達到初始 99.4%，但相對于衰減后的轉(zhuǎn)化率77.4%，提高了12.6%?？梢?，脫脂棉-PCL可多次重復(fù)利用，其活力衰減后，可通過加水重新固定再次提高酶催化活性。

圖5 脫脂棉-PCL瓶型反應(yīng)器重復(fù)催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率（a）及使用6次后的GC譜圖（b）

2.5 不同種脫脂棉-PCL的催化效果比較

脫脂棉-PCL可以在柱形瓶中也可以在表面皿中固定制備。兩種脫脂棉-PCL在柱形瓶中，在相同條件下催化反應(yīng)的動力學如圖6所示。由圖可見，在玻璃瓶中固定得到的脫脂棉-PCL（脫脂棉10 mg）催化效率較高，在反應(yīng)2 h時，其催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率是表面皿中固定所得脫脂棉-PCL（脫脂棉10 mg）催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的2.2倍，盡管如此，后者的活性相對于酶粉還是較高的（圖2）。這可能是因為后者在從表面皿轉(zhuǎn)移到玻璃瓶的過程中，酶會有部分損失，通過稱量估算，其平均損失率約 9.3%。雖然，表面皿中固定所得脫脂棉-PCL的催化效率相對于柱形玻璃瓶中固定所得脫脂棉-PCL較低，但在反應(yīng)時間達到24 h后，其轉(zhuǎn)化率也達到了77.0%（圖6）。此外，在柱形玻璃瓶中制備脫脂棉固定PCL，水分揮發(fā)慢，在37 ℃、160 r/min條件下固定10 mg的PCL需7 h，而在表面皿上制備脫脂棉-PCL，僅需1.5 h，大大縮短了固定化操作的時間。

圖6 兩種脫脂棉-PCL酶促動力學（37 ℃、0 r/min）

2.6 脫脂棉-PCL在滴定管中催化反應(yīng)

將表面皿中固定的脫脂棉-PCL裝入酸式滴定管中，盡可能保持脫脂棉蓬松，并加入反應(yīng)液，催化反應(yīng)，如圖1（b）。通過對流出反應(yīng)液分析發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)產(chǎn)率隨時間的延長而增大，室溫下反應(yīng)5 h，產(chǎn)率達到73.6%，繼續(xù)延長反應(yīng)時間產(chǎn)率增加變?。▓D7）。這可能是因為，在這種反應(yīng)器中，上部反應(yīng)液與下部接觸脫脂棉-PCL的反應(yīng)液間沒有隔離，導致上下反應(yīng)液間通過分子運動而混合，使試驗測定結(jié)果偏低。在今后的試驗中，將進一步改進這種脫脂棉-PCL管式反應(yīng)器，提高酶促轉(zhuǎn)化率，以達到室溫和靜置條件下間歇式制備乙酸正戊酯的效果。

圖7 脫脂棉-PCL管式反應(yīng)器中酶促反應(yīng)動力學

3 結(jié)論

在本試驗中，以脫脂棉纖維為固定化載體材料，通過物理吸附，將PCL酶固定在脫脂棉上，與反應(yīng)裝置一起構(gòu)成簡易的生物反應(yīng)器，用于催化正戊醇和乙酸乙烯酯反應(yīng)合成乙酸正戊酯，達到了較好的催化效果。在脫脂棉-PCL瓶型反應(yīng)器中，25 ℃、靜置條件下，反應(yīng)24 h，轉(zhuǎn)化率可達97%。相較于傳統(tǒng)催化方法的強酸強堿、高溫等催化條件，脫脂棉-PCL催化反應(yīng)具有操作簡單，且低碳、高效的特點。在脫脂棉-PCL管式反應(yīng)器中，常溫靜置的條件下，經(jīng)5 h的催化，也達到了較好的催化效果，有望將來改造成間歇式生產(chǎn)重要酯類化合物的綠色、低碳生產(chǎn)設(shè)備。