●宋冉

George Church 教授及其學生Ying Kai Chan

疫情之下，基因療法賽道持續(xù)火熱。有業(yè)內人士認為，基因療法即將“引領生物醫(yī)藥的第三次產(chǎn)業(yè)革命”，會成為繼化學小分子藥物、生物大分子藥物之后的第三代治療藥物。

不過，基因治療始終繞不過的一道坎就是遞送，遞送技術是打開基因治療大門的“鑰匙”。

常用的遞送工具有AAV、LNP、外泌體等，其中AAV 是基因治療臨床上最常用的載體技術，也是FDA 批準上市的基因治療藥物中最安全的病毒載體之一?，F(xiàn)在，有超過2/3 的基因療法公司都在使用AAV 作為遞送工具。究其本原是因為AAV 是非致病性的，而且可以有效靶向組織和器官。

然而，正如硬幣的正反面一樣，AAV 亦有其兩面性，正所謂成也病毒，敗也病毒。有臨床試驗數(shù)據(jù)顯示，基因治療載體AAV 會引起強烈的天然免疫反應，這可能會降低治療效果，甚至引發(fā)嚴重的副作用。2020 年發(fā)生了3 例由于高劑量用藥而引發(fā)的基因療法致死案例，雖然現(xiàn)在還沒有證據(jù)證明始作俑者是免疫原性，但是卻引發(fā)了人們對于AAV 載體安全性的擔憂。

過度免疫反應是基因治療的一大挑戰(zhàn)，科學家們一直在尋求優(yōu)化和改進AAV 載體，降低免疫反應。

近日，由“當代基因組學教父”George Church 領銜的哈佛團隊在Science Translational Medicine 發(fā)表了一項AAV 載體的最新研究。研究顯示，他們利用“偶聯(lián)免疫調節(jié)”（coupled immunomodulation）開發(fā)了一種“更安全”的AAV 載體，這種經(jīng)工程化修飾的AAV 載體可以明顯減少炎癥和T 細胞反應，同時改善小鼠和豬模型中的基因表達。

Ying Kai Chan 告訴生輝：“ 在基因療法臨床試驗中，減低或者消除免疫反應難題的常用策略是服用免疫抑制性藥物，包括全身用糖皮質激素或者減少病毒載體中的CpG。我們的方法利用了合成生物學思維，采用了‘即插即用’的方式，將人體內發(fā)揮免疫監(jiān)視作用的基因片段插入AAV 載體DNA 序列中，幫助AAV 實現(xiàn)‘隱身’?！彼荊eorge Church 的學生，也是這項研究的第一作者。

George Church、Ying Kai Chan 等成立了一家基因療法公司Ally Therapeutics，專注于破解AAV 免疫原性難題，開發(fā)“更安全”的AAV 載體及其基因療法。

Crunchbase 的數(shù)據(jù)顯示，公司成立伊始，便獲得了美國生命科學領域知名風投機構Arch Venture Partners、Alta Partners，和企業(yè)戰(zhàn)略風險投資基金UCB Ventures 的種子輪融資。

Science Translational Medicine

給AAV 穿上“隱身衣”

模式識別受體—— Toll 樣受體（TLR）是一類跨膜受體，在機體免疫活動中扮演重要角色。目前，在哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)了11 個TLR家族成員，其中機理較為清楚的是TLR2、TLR4、TLR5 和TLR9。

基因治療先驅詹姆斯威爾遜（James Wilson）最先證明了當AAV 載體進入人體細胞中，人體可以通過一組TLR 對AAV 做出反應。可以說TLR 是AAV 載體進入人體細胞后引發(fā)過度免疫反應的“幕后推手”。

具體來說，當AAV 載體進入人體細胞后，體內抗原提呈細胞DC 細胞、巨噬細胞等，通過模式識別受體TLR9、TLR2 等檢測識別AAV 載體上的病原體相關分子模式，并激活下游的相關信號通路，誘導炎癥和致敏等過度免疫反應。比如血液中的漿細胞樣DC（pDC）、肝臟中的庫普弗細胞（Kupffer cell）的TLR9 可以識別AAV 基因組核酸。

詹姆斯威爾遜把TLR 比作是天然免疫的“哨兵”，TLR 能夠監(jiān)視與識別各種不同的病原體相關分子模式（PAMP）。這些“哨兵”是免疫系統(tǒng)的第一道防線，如果它們發(fā)現(xiàn)任何抗原，就會立刻發(fā)出警報。這就意味著，正常細胞需要一種方法來告訴TLR 受體自己是安全的，無需啟動防御系統(tǒng)。

George Church、Ying Kai Chan 等哈佛團隊正是通過抑制TLR9 的激活，實現(xiàn)了AAV 載體的“隱身”。

在研究中，我們以“即插即用”的方式TLR9 抑制序列整合到AAV2 血清型病毒載體中，當AAV 進入體內后，這些基因序列會與體內的TLR 受體結合，并告訴這些受體無需啟動免疫警報系統(tǒng)，這樣就相當于給AAV2 穿上了‘隱身衣’。這種‘隱身’的AAV 也可以稱為AAV2.0，進入體內后可以減輕天然免疫和炎癥反應，甚至增加有效載荷的表達。

在論文中研究人員們寫道：“這種‘偶聯(lián)免疫調節(jié)’策略可以實現(xiàn)‘即插即用’，可能為不同的AAV 基因治療提供一種通用的、廣泛適用的解決方案，同時也不會影響衣殼或載體基因組元件等。”

Ying Kai Chan 還向媒體透露，他們研究小組將修飾后的AAV 注射到豬和小鼠模型的肌肉，肝臟和眼睛中后，AAV 引發(fā)的免疫反應比傳統(tǒng)載體明顯減少。

哈佛大學的研究小組認為，在動物模型中令人鼓舞的結果表明了抑制TLR9 可以生產(chǎn)更安全、更有效的AAV 載體，從而避免AAV 基因組引發(fā)的免疫應答。

不過在猴子身上的表現(xiàn)并不明顯。該研究團隊將這種載體注射到了非人靈長類動物的眼睛中，在視網(wǎng)膜下給藥時，顯示出了更高的安全性；直接注射到猴子玻璃體腔內時，仍然引發(fā)了明顯的炎癥反應?！疤魬?zhàn)仍然存在?！盰ing Kai Chan 說。

Ying Kai Chan 在接受外媒采訪時還表明，新論文只是其修飾AAV 的1.0 版，此后他們還對AAV 進行了重大改進。

誠然如此，AAV 還有很長的路要走。比如說，動物模型仍然不能很好地預測人類免疫反應，在安全性試驗中還存在很大的漏洞。在猴子身上表現(xiàn)出免疫沉默的載體仍可能引發(fā)人體免疫反應，反之亦然。盡管AAV 在動物體內的作用已有充分文獻記載，但仍不清楚TLR在人體內對AAV 反應中所扮演的角色。

現(xiàn)在，Ally Therapeutics 將利用TLR9 編輯的AAV 技術平臺，尋求開發(fā)免疫原性較低的基因療法。

降低免疫原性的其他方式

有業(yè)內相關人士表示，AAV 作為一種常用的遞送工具，需要特別關注以下幾點。第一，一定要降低免疫源性，避免人體中和抗體對它的清除；第二，必須要有非常高的組織特異性，才能夠把病毒內的核酸正常遞送到組織細胞的表面；第三，轉導率，病毒的轉導率取決于遞送內容有多少能夠進到細胞內部。

衣殼蛋白和基因組都是AAV 免疫原性成分，AAV 的衣殼蛋白決定了其對不同組織的靶向性及免疫原性，也有不少科學家通過改造衣殼蛋白的方式降低AAV 的免疫原性。

經(jīng)工程化改造的AAV 衣殼蛋白

擁有DNA 合成和測序背景的埃里克·凱爾西奇利用AI 系統(tǒng)優(yōu)化并篩選AAV 衣殼，其搭建的AI 技術平臺可以對一種特定AAV 血清型的所有衣殼變體進行高通量篩選。其創(chuàng)立的基因療法公司Dyno Therapeutics 正在基于其AI 篩選平臺開發(fā)更安全的“下一代”基因治療載體。

而馬賽諸塞州眼耳醫(yī)院基因治療中心的負責人盧克范登伯格則持有不同的看法。據(jù)了解，盧克范登伯格曾經(jīng)嘗試了埃里克凱爾西奇利用AI 優(yōu)化AAV 衣殼的方式，但是失敗了。因此，他對于埃里克凱爾西奇是否有足夠的知識用通過AI 改造優(yōu)化AAV 衣殼蛋白表示懷疑。

“該領域在開發(fā)攜帶大片段基因以及躲避中和抗體的載體方面能力很薄弱”。盧克范登伯格說。

他創(chuàng)立的基因療法Affinia Therapeutics 目前正在利用專有的AAV 文庫和技術改造病毒衣殼蛋白的免疫原性和組織定向性，治療領域集中在中樞神經(jīng)疾病和肌肉疾病。

而George Church、Ying Kai Chan 使用的方式不同，他們的方法只是將抑制性TLR9 基因片段整合到了AAV 載體中，不會影響衣殼或載體基因組元件。哈佛研究團隊認為，抑制TLR9 這一路徑可能在解決AAV 基因療法引發(fā)的高免疫原性問題中扮演更為重要角色。

有業(yè)內人士預言，2021 年將會是“細胞基因治療年”。作為基因治療的“命門”，AAV 仍是當下基因遞送工具中的最優(yōu)解。無論是AAV改造衣殼蛋白還是其基因組，進一步提高AAV的安全性和有效性將會被是未來基因治療公司需要不斷演算的一道必答題。