李 燕 潘炎帆 張 濤 韓忠耀

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558000)

千里光為菊科植物千里光(SenecioscandensBuch.-Ham)的干燥地上部分[1-2]，具有清熱解毒、明目退翳、殺蟲止癢、散瘀消腫等功效[3-4]，以及抗菌抗病毒、抗癌、消炎利膽等藥理作用，被廣泛應(yīng)用于各種急性炎癥的治療[5]。其主要活性成分以總黃酮、總生物堿、金絲桃苷、綠原酸為代表。研究[6-7]表明，黔產(chǎn)千里光活性成分含量以8月份地上部分含量最高。目前，關(guān)于千里光的研究多以成分、藥理作用及含量測定為主，有關(guān)千里光生品指紋圖譜相關(guān)報(bào)道較少[8]，而關(guān)于千里光炮制后的指紋圖譜以及含量變化規(guī)律尚未見報(bào)道。

試驗(yàn)擬以黔產(chǎn)千里光為研究對象，分析其炮制前后HPLC指紋圖譜，同時(shí)測定炮制前后的總黃酮、總生物堿、金絲桃苷、綠原酸含量變化規(guī)律，旨在揭示炮制對該藥的影響，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

千里光：自采藥材(表1)，采集時(shí)間為2018年8月，采集藥材均經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校王傳明副教授鑒定為菊科植物千里光(S.scandensBuch.Ham)全草，樣本保存于黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中藥標(biāo)本館；

蘆丁對照品(批號(hào)CHB170303，純度≥98%)、苦參堿對照品(批號(hào)CHB160907，純度≥98%)、綠原酸對照品(批號(hào)CHB170713，純度≥98%)、金絲桃苷對照品(批號(hào)CHB160904，純度≥98%)：成都克洛瑪生物科技有限公司；

表1 千里光藥材采集信息表

乙腈：色譜純，重慶川東化工有限公司；

純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；

其余試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：Agilent1260型，美國安捷倫科技有限公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：Cary 100型，美國安捷倫科技有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：SG-4050C型，上海碩光電子科技有限公司；

離心機(jī)：2.0R型，德國Heraeus公司；

電子天平：DV215CD型，奧豪斯儀器上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]并略作修改。精密稱取蘆丁對照品和苦參堿對照品，分別置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分別為0.352 0，0.262 0 mg/mL的蘆丁對照品溶液和苦參堿對照品溶液；精密稱取綠原酸對照品和金絲桃苷對照品，置于同一50 mL容量瓶中，加入75%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液，其中綠原酸、金絲桃苷濃度分別為0.164 0，0.084 0 mg/mL。

1.2.2 炮制品及供試品溶液的制備 取地上部分于55 ℃下烘干備用，得千里光生品。取烘干后的千里光，每100 g藥材加入25 g米醋，悶潤2 h，文火炒至藥材顏色加深，取出放涼備用，得醋炙千里光。取烘干后的千里光生品、醋炙品粉末(過65目篩)約1.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇100 mL，稱定質(zhì)量，回流提取1.0 h，靜置放冷再稱量，70%乙醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，過濾，濾液于0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 根據(jù)文獻(xiàn)[8]并略作修改。色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.1%磷酸水(A)—乙腈(B)，梯度洗脫：0～5 min，2% B；6～10 min，2%～7%B；11～35 min，7.0%～16% B；36～50 min，17%～25% B；51～65 min，25%～100% B。流速1.0 mL/min，樣品進(jìn)樣量20 μL，對照品進(jìn)樣量5 μL，柱溫35 ℃，檢測波長327 nm，檢測時(shí)間65 min。

1.2.4 方法學(xué)考察

(1) 線性關(guān)系考察：參照文獻(xiàn)[6-7]。

(2) 精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性試驗(yàn)：參照文獻(xiàn)[9-10]。

(3) 加樣回收率試驗(yàn)：取已知含量的同一樣品提取液6份，分別精密加入綠原酸、金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.5 聚類分析 參照文獻(xiàn)[11-12]的方法，將10批千里光生品(S1～S10)和醋炙品(G1～G10)作為研究對象，采用聚類分析法，觀察不同批次藥材之間的差異性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(國家藥典委員會(huì)2004A版)，對指紋圖譜進(jìn)行相似度評價(jià)。聚類分析利用SPSS 18.0軟件，采用組間連接法，選用平方Euclidean距離作為刻度，分別進(jìn)行聚類。采用Excel軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

蘆丁和苦參堿的檢測波長參照文獻(xiàn)[6-7]，分別選擇509，208 nm。采用二極管陣列檢測器對千里光供試品溶液進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)327 nm下的出峰數(shù)目最多，基線相對穩(wěn)定，且分離峰之間的分離效果也較好，同時(shí)綠原酸和金絲桃苷在327 nm下吸收信號(hào)較強(qiáng)，達(dá)到了有效分離，故最終確定檢測波長為327 nm。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度或峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.2 其他 由表3可知，36 h內(nèi)儀器的精密度、方法的重復(fù)性及供試品穩(wěn)定性均在3%以內(nèi)，表明儀器精密度、方法的重復(fù)性及供試品36 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

表3方法學(xué)考察試驗(yàn)結(jié)果

Table3Theresultsofmethodologicalexperimental (n=6) %

名稱精密度RSD重復(fù)性RSD穩(wěn)定性RSD蘆丁0.981.431.44 苦參堿0.691.261.36綠原酸 相對保留時(shí)間0.310.340.29相對峰面積1.521.691.57金絲桃苷相對保留時(shí)間0.350.410.47相對峰面積1.621.391.62

2.2.3 加樣回收率試驗(yàn) 結(jié)果表明，綠原酸、金絲桃苷的平均加樣回收率分別為101.57%，99.68%，且RSD<2.08%，表明所建立的方法回收率良好。

2.3 指標(biāo)性成分及參照峰的選擇

綠原酸、金絲桃苷、總黃酮、總生物堿為千里光的主要活性物質(zhì)，故將其作為指標(biāo)性成分。由圖1可知，綠原酸是千里光含量較高的活性成分，指紋圖譜中其峰面積較大，且保留時(shí)間為22.41 min，保留時(shí)間適中，故確定3號(hào)峰(綠原酸)為指紋圖譜的參照峰。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC圖

Figure 1 The HPLC chromatograms of the mixed reference substance

2.4 指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 指紋圖譜的建立 由圖2～5可知，3(S)號(hào)峰為綠原酸吸收峰，9號(hào)峰為金絲桃苷吸收峰；10批千里光生品與醋炙品指紋圖譜分別確立12，8個(gè)共有峰，其中，生品共有峰為1～12號(hào)峰(見圖4)，醋炙品共有峰為1，2，3，4，7，8，9，12號(hào)峰(見圖5)，表明醋炙顯著降低或改變了藥材成分。

由表4～7可知，生品共有峰的相對保留時(shí)間RSD<0.31，醋炙品共有峰的相對保留時(shí)間RSD<0.44，說明儀器分析條件穩(wěn)定、可行，但二者共有峰的相對峰面積RSD較大，表明不同批次的生品和醋炙品成分含量均差異較大。

圖2 千里光生品HPLC指紋圖譜

Figure 2 HPLC fingerprints of rawS.scandensBuch.Ham

圖3 千里光醋炙品HPLC指紋圖譜

Figure 3 HPLC fingerprints of vinegar processedS.scandensBuch.Ham

圖4 千里光生品對照指紋圖譜

Figure 4 Control fingerprints of the rawS.scandensBuch.Ham

圖5 千里光醋炙品對照指紋圖譜

Figure 5 Control fingerprints of the vinegar processedS.scandensBuch.Ham

表4 千里光生品共有峰的相對保留時(shí)間

表5 千里光生品共有峰的相對峰面積

表6 千里光醋炙品共有峰的相對保留時(shí)間

2.4.2 相似度評價(jià) 由表8～9可知，生品與其對照圖譜的相似度為0.990～0.999，醋炙品與其對照圖譜相似度為0.818～0.997，表明除醋炙品G1批(相似度為0.818)外，10批千里光生品與醋炙品相似度均>0.987，說明其質(zhì)量相對穩(wěn)定可控。

表7 千里光醋炙品共有峰的相對峰面積

表8 千里光生品指紋圖譜的相似度計(jì)算

表9 千里光醋炙品指紋圖譜的相似度計(jì)算

圖6 千里光生品、醋炙品聚類分析樹狀圖

2.4.3 系統(tǒng)聚類分析 由圖6可知，聚類分析將10批千里光生品和醋炙品均聚為2類，千里光生品中，S9單獨(dú)聚為一類，其他聚為一類；千里光醋炙品中，G3單獨(dú)聚為一類，其他聚為一類。由于生品與醋炙品共有峰數(shù)量不同，聚類分析時(shí)，不建議將兩者合并進(jìn)行聚類分析。

2.5 多成分含量測定

由表10可知，不同采集地的千里光炮制前后各指標(biāo)成分含量差異較大，醋炙千里光中各成分含量較生品均有所降低，與生品相比總黃酮含量降低了41.83%，總生物堿下降了38.97%，綠原酸下降了57.64%，金絲桃苷下降了51.28%，與指紋圖譜測定結(jié)果吻合，表明炮制前后二次代謝產(chǎn)物有顯著性變化。

表10千里光不同炮制品中多成分含量

Table10ThecontentofvariousconstituentsofrawandprocessedGuizhouS.scandensBuch.Ham (n=10) mg/g

樣品總黃酮總生物堿綠原酸金絲桃苷生品 72.92±1.221.36±0.896.61±0.091.95±0.25醋炙品42.42±0.410.83±0.112.80±0.090.95±0.12

3 結(jié)論

比較了10批黔產(chǎn)千里光炮制前后的指紋圖譜及多成分含量。結(jié)果表明，千里光中綠原酸、金絲桃苷、總黃酮及總生物堿含量與產(chǎn)地和采收期有關(guān)，醋炙品中綠原酸、金絲桃苷、總黃酮及總生物堿含量較生品均有明顯降低，說明醋炙對千里光多成分含量產(chǎn)生了不同程度的影響。試驗(yàn)僅對千里光炮制前后的指紋圖譜及含量進(jìn)行了初步研究，針對千里光炮制前后的藥理活性還有待進(jìn)一步研究。