董 昕 白景妙 吳海燕

(1. 品測(cè)〔上?！硻z測(cè)科技有限公司，上海 201108；2. 山東美正生物科技有限公司，山東 青島 266000；3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266000)

貝類(lèi)毒素亦稱(chēng)赤潮生物毒素，是由有害赤潮生物產(chǎn)生的天然活性物質(zhì)。赤潮是在特定的環(huán)境下，海水中原生生物、浮游生物或細(xì)菌爆發(fā)性增殖造成水體變色的生態(tài)現(xiàn)象。在5 000多種海洋微藻中，可以形成赤潮的微藻至少有180種，其中有毒的藻類(lèi)占據(jù)近1/2，已被證實(shí)含有毒素或者能夠分泌毒素的有30～40種[1]。因研究人員最早從貝類(lèi)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)赤潮毒素，故稱(chēng)此類(lèi)毒素為貝類(lèi)毒素。赤潮毒素隨著濾食性魚(yú)、蝦、貝類(lèi)的濾食活動(dòng)被富集在體內(nèi)，造成海產(chǎn)品毒化。毒化的海產(chǎn)品通過(guò)食物鏈的傳遞最終導(dǎo)致人體中毒。

神經(jīng)性貝類(lèi)毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning，NSP)是由短裸甲藻、劇毒岡比甲藻等藻類(lèi)在細(xì)胞裂解、死亡時(shí)會(huì)釋放出一組效力較大的神經(jīng)毒素。高濃度的神經(jīng)毒素很容易造成魚(yú)類(lèi)的大批量死亡，相反牡蠣、蛤類(lèi)和貽貝對(duì)該毒素不敏感，外表上完全呈現(xiàn)出健康狀態(tài)[2]。神經(jīng)性貝類(lèi)毒素是一類(lèi)脂溶性環(huán)狀聚醚類(lèi)毒素，可造成誤食者神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道不適，引發(fā)惡心、嘔吐、腹瀉、痙攣、支氣管收縮、麻痹、抽搐和昏迷等癥狀。其中短裸甲藻毒素(Brevetoxin，BTX)是主要的一類(lèi)毒素成分，主要由裸甲藻、海洋卡盾藻和赤潮異彎藻產(chǎn)生，其基本結(jié)構(gòu)分為A型(BTX-A，即PbTx-A)和B型(BTX-B，即PbTx-B)，包含數(shù)十種衍生物，以BTX-2(即PbTX-2)最為常見(jiàn)[3-4]。

目前美國(guó)、澳大利亞和新西蘭等國(guó)家規(guī)定小鼠生物法安全標(biāo)準(zhǔn)為20 MUs/100 g，相當(dāng)于800 μg PbTX-2/kg貝肉組織[5]，而中國(guó)尚無(wú)針對(duì)此類(lèi)毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，一般針對(duì)此類(lèi)毒素的限量值是參考?xì)W美限量。

國(guó)際上普遍采用小鼠生物法、免疫分析法、細(xì)胞毒性檢測(cè)法及理化分析方法等手段來(lái)檢測(cè)貝類(lèi)并作出預(yù)警預(yù)報(bào)[6-10]。小鼠生物法是檢測(cè)貝類(lèi)毒素發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的分析方法，但存在靈敏度差、步驟繁瑣、無(wú)法確定毒素組分、重復(fù)性差(不同批次、不同品系小鼠)、易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果等問(wèn)題。酶聯(lián)免疫法雖檢測(cè)時(shí)間短、成本低，但易受交叉反應(yīng)的影響而出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性的問(wèn)題。液相色譜法需要復(fù)雜的前處理，且缺乏準(zhǔn)確的定性能力。液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了液相色譜優(yōu)越的分離能力與質(zhì)譜高靈敏度的定性定量功能，應(yīng)用越來(lái)越廣泛。但市場(chǎng)上存在的一些固相萃取柱產(chǎn)品，回收率低、樣品基質(zhì)干擾仍較嚴(yán)重，大大降低了方法的應(yīng)用率[11-13]。免疫親和柱(immunoaffinity column，IAC)是一種基于抗原抗體反應(yīng)的新型層析柱，可選擇性吸附樣品提取液中的目標(biāo)化合物，在特異性富集毒素的同時(shí)凈化樣品基質(zhì)，凈化效果好。作為新型高效的前處理凈化技術(shù)，免疫親和柱凈化技術(shù)正在不斷改進(jìn)發(fā)展，在生物毒素檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越廣泛[14-16]。

試驗(yàn)擬以PbTX-2為研究對(duì)象，研制NSP免疫親和柱的裝柱，并建立NSP的免疫親和柱凈化—液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，以期經(jīng)免疫親和柱凈化的樣品提取液可直接用于LC-MS/MS分析，達(dá)到快速檢測(cè)和提高檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確性的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貽貝、蛤蜊、牡蠣、扇貝樣品：市售；

PbTX-2標(biāo)準(zhǔn)品：純度99.5%，美國(guó)LKT LABS公司；

甲酸、甲酸銨：色譜純，美國(guó)Sigma公司；

甲醇、乙腈：色譜純，德國(guó)Merck公司；

十二水合磷酸氫二鈉、氯化鈉、鹽酸、碳酸氫鈉、二水合磷酸二氫鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒：賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；

瓊脂糖凝膠：上海通用電器有限公司；

0.22 μm有機(jī)微孔濾膜：上海安普科學(xué)儀器有限公司；

試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜—四極桿/離子阱復(fù)合質(zhì)譜：AB 5500 QTrap型，美國(guó)SCIEX公司;

純水儀：MILLI-Q型，美國(guó)Millipore公司；

分析天平：ME204型，瑞士梅特勒—托利多公司；

旋窩振蕩器：Talboys型，美國(guó)Talboys公司；

高速離心機(jī):Himac CR 22G II型，日立Hitachi公司；

氣控操作架:HM09004-1型，北京美正生物科技有限公司。

1.3 NSP免疫親和柱的制備

1.3.1 PbTX-2單克隆抗體制備 采用動(dòng)物體內(nèi)誘生單克隆抗體法合成PbTX-2全抗原對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，取小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0進(jìn)行融合，篩選出特異性強(qiáng)、靈敏度高、能分泌抗PbTX-2的單克隆抗體細(xì)胞株，通過(guò)液體石蠟注射到小鼠腹腔內(nèi)致命，然后將分泌抗PbTX-2的細(xì)胞接種到小鼠體內(nèi)，制備抗PbTX-2的單克隆抗體腹水。使用Protein G柱進(jìn)行抗體純化[17]。

1.3.2 PbTX-2抗體蛋白濃度測(cè)定 將PbTX-2抗體溶液用BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。測(cè)得該P(yáng)bTX-2抗體溶液蛋白濃度為2 mg/mL。

1.3.3 NSP免疫親和柱的制備 將純化后的PbTX-2抗體加入處理好的Sepharose CL 4B凝膠中[18]，具體步驟：

(1) 凝膠制備：將2 g溴化氫活化的Sepharose CL 4B 干粉加入到25 mL 1 mmol/L的HCl溶液中溶脹，將膠轉(zhuǎn)入砂芯漏斗中，然后用200 mL 1 mmol/L的HCl清洗，再用200 mL反應(yīng)緩沖液(0.1 mol/L碳酸氫鈉)清洗充分。

(2) 偶聯(lián)：清洗完后抽干，將膠加入10 mL含有0.5 mg/mL PbTX-2的抗體偶聯(lián)緩沖液溶液中，室溫溫和攪拌2 h或過(guò)夜反應(yīng)，反應(yīng)完成后靜置，收集上清，BCA法測(cè)定上清液中未偶聯(lián)蛋白含量，按式(1)計(jì)算偶聯(lián)率，經(jīng)測(cè)定制備的NSP抗體與凝膠的偶聯(lián)率為100%。

(1)

式中：

p——偶聯(lián)率，%；

m1——偶聯(lián)前抗體總量，mg；

m2——未偶聯(lián)抗體總量，mg。

(3) 洗滌：用反應(yīng)緩沖液洗滌反應(yīng)后的膠，將膠加入15 mL Tris-HCl (0.1 mol/L，pH 8.0)緩沖液中，室溫下溫和攪拌2 h。用600 mL 0.1 mol/L醋酸緩沖液(pH 4.5)和Tris-HCl先后交替進(jìn)行洗滌4～6次。

(4) 裝柱：洗滌后的凝膠用250 mL PBS充分平衡后裝柱，取3 mL空柱管壓好底部篩板，然后將膠平均裝到10支3 mL柱管中，堵好上下堵頭，做好標(biāo)識(shí)，儲(chǔ)存于2～8 ℃。每根柱凝膠體積為0.5 mL，相當(dāng)于每根柱含有0.3 mg NSP抗體。

1.3.4 NSP免疫親和柱的柱容量驗(yàn)證 為了評(píng)價(jià)自制NSP免疫親和柱的效果，通過(guò)不同上樣量的回收試驗(yàn)，測(cè)試自制柱的柱容量。分別移取1 mL濃度為200，400，1 000，1 600 ng/mL的PbTX-2標(biāo)準(zhǔn)溶液與20 mL PBS溶液混合均勻，全部添加到制備的免疫親和柱上，以1 mL/min的流速流出，然后用6 mL 20%甲醇水溶液淋洗免疫親和柱，流速2～3滴/s，流干柱內(nèi)殘留液，并棄去以上全部流出液。最后用3 mL甲醇洗脫，流速1滴/s，收集洗脫液，室溫中氮吹至小于1 mL，用甲醇補(bǔ)至1 mL?；靹蚝笥?.22 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算柱容量，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 PbTX-2上樣量與回收率

由表1可知，自制免疫親和柱的上樣量在1 000 ng以下回收率均達(dá)到90%以上，而上樣量在1 000 ng以上時(shí)，回收率下降。因此自制免疫親和柱的最大柱容量為1 000 ng。

1.4 NSP免疫親和柱的應(yīng)用

1.4.1 NSP標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱(chēng)取一定量的PbTX-2粉末，用純甲醇稀釋至1 mg/mL，-18 ℃避光保存，有效期1年。根據(jù)PbTX-2在LC-MS/MS上響應(yīng)值和線(xiàn)性相關(guān)性，將母液稀釋濃度為5，10，20，50，100，200，500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4.2 樣品前處理 準(zhǔn)確稱(chēng)取已充分均質(zhì)樣品2.00 g于50 mL具塞試管中，加入8 mL 80%甲醇水溶液，渦旋震蕩2 min，超聲提取10 min，8 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至20 mL刻度玻璃管中。然后加入8 mL 80%甲醇水溶液重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，用80%甲醇水溶液定容至20 mL。移取5 mL提取液，加入20 mL PBS溶液稀釋(稀釋2倍)，全部過(guò)免疫親和柱凈化。

取出免疫親和柱去掉上方塞子，安裝上轉(zhuǎn)接頭，將轉(zhuǎn)接頭另一端與針筒連接固定后使用。將柱子直接與氣控操作架上的針筒連接固定，處理后的溶液上樣，上樣結(jié)束后用6 mL 20%甲醇水溶液淋洗免疫親和柱，流速2～3滴/s，流干柱內(nèi)殘留液，并棄去以上全部流出液。最后用3 mL甲醇洗脫，流速1滴/s，洗脫液定容至4 mL，混勻后用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3 NSP儀器檢測(cè)條件

(1) 色譜條件：色譜柱為Kinetex，XB-C18柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；進(jìn)樣體積5 μL；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相A為去離子水(含50 mmol/L甲酸和2 mmol/L甲酸銨)；流動(dòng)相B為95%乙腈水溶液(含50 mmol/L甲酸和2 mmol/L甲酸銨)；洗脫條件0.0 min(80% A)→5.0 min(10% A)→10.0 min(10% A)→10.1 min(80% A)→12.0 min(80% A)。

(2) 質(zhì)譜條件：檢測(cè)類(lèi)型為電噴霧離子源，正離子掃描模式(Electrospray ionization，ESI+)；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(Multiple Reaction Monitor，MRM)；毛細(xì)管電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；氣簾氣壓力206 kPa；霧化氣壓力345 kPa；輔助加熱氣壓力345 kPa；碰撞氣CAD中等流量；定量離子對(duì)895.4>877.4，碰撞能量26 eV；定性離子對(duì)895.4>859.6，碰撞能量30 eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫親和柱的制備

2.1.1 凝膠溶脹溶液體積的選擇 將2 g溴化氫活化的Sepharose CL 4B干粉分別加入15，20，25，30 mL 1 mmol/L的HCl溶液中溶脹。試驗(yàn)結(jié)果顯示溶脹液體積在25 mL以下干粉溶脹不完全，因此選擇25 mL溶脹液對(duì)Sepharose CL 4B干粉進(jìn)行溶脹。

2.1.2 偶聯(lián)反應(yīng)方式 選用室溫溫和攪拌0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h使其充分偶聯(lián)，經(jīng)測(cè)定室溫?cái)嚢?～4 h的偶聯(lián)率均為100%，而攪拌1 h以下的偶聯(lián)率低于80%，所以選擇室溫偶聯(lián)時(shí)間為2 h。

2.2 免疫親和柱的應(yīng)用優(yōu)化

2.2.1 稀釋緩沖液的確定 抗體對(duì)有機(jī)溶劑的敏感性是免疫親和柱凈化和富集過(guò)程中的一個(gè)重要因素，影響免疫反應(yīng)的活性。抗體對(duì)甲醇溶液有一定程度的耐受能力，若上樣液中甲醇濃度過(guò)高會(huì)破壞抗原抗體的結(jié)合。因此選擇適合的緩沖液稀釋是獲得高回收率的關(guān)鍵。PBS磷酸鹽緩沖溶液具有鹽平衡、可調(diào)整的適宜pH緩沖作用，所以選擇PBS樣品稀釋緩沖液。

以添加量為200 ng的扇貝樣品提取液為基準(zhǔn)，用PBS進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)比較不同稀釋倍數(shù)下樣品回收率，確定最佳稀釋比例。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)圖1。

圖1 PBS不同稀釋比例對(duì)回收率的影響

由圖1可得，NSP免疫親和柱對(duì)甲醇的耐受能力在20%左右，隨著上樣液中甲醇濃度的增加，破壞了抗原抗體的特異性結(jié)合，使部分毒素結(jié)合不牢固而流失，造成樣品回收率降低。當(dāng)樣品液∶PBS體積比為1∶4時(shí)樣品回收率達(dá)到90%以上。因此選擇稀釋比例為1∶4。

2.2.2 淋洗液的確定 考慮到PbTx-2的溶解性，為驗(yàn)證淋洗過(guò)程中淋洗液(20%甲醇水溶液)是否會(huì)造成損失，收集全部6 mL(2 倍柱體積)淋洗液進(jìn)行LC-MS/MS測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淋洗過(guò)程中無(wú)損失，當(dāng)淋洗液中甲醇濃度<20%時(shí)，不能使PbTx-2溶解，而當(dāng)淋洗液中甲醇濃度>20%時(shí)，破壞了抗原抗體的特異性結(jié)合，PbTx-2的回收率明顯降低，故最終選擇6 mL 20%甲醇水溶液淋洗免疫親和柱。

2.2.3 洗脫液的確定 對(duì)PBS溶液進(jìn)行加標(biāo)(加標(biāo)量200 ng)，不添加樣品基質(zhì)以排除基質(zhì)干擾，以水、50%甲醇水溶液、甲醇、2%氨水甲醇溶液作為洗脫液，做3組平行試驗(yàn)，同時(shí)采用不同洗脫體積進(jìn)行洗脫收集，以回收率為指標(biāo)篩選出最佳洗脫液和洗脫體積，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 洗脫液對(duì)回收率的影響

由表2可知，用水、50%甲醇水溶液、2%氨水甲醇溶液洗脫時(shí)，PbTX-2的回收率分別為1.02%，57.11%，1.47%，回收率均偏低；分別用2，3，4 mL甲醇洗脫，回收率分別為74.27%，90.24%，89.38%。試驗(yàn)表明：洗脫液體積≥3 mL時(shí)，PbTX-2能被洗脫出來(lái)。洗脫液體積過(guò)多時(shí)會(huì)造成試劑浪費(fèi)，故最終選擇3 mL甲醇作為洗脫溶劑。

2.2.4 樣品提取試劑的確定 PbTx-2具熱穩(wěn)定性，易溶解于甲醇、乙醚等有機(jī)試劑，參考GB 5009.198—2016方法中對(duì)貝類(lèi)樣品的提取試劑，同時(shí)考慮到DSP免疫親和柱的前處理過(guò)程[12]，試驗(yàn)比較了20%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液和80%甲醇水溶液的提取效率。提取加標(biāo)量為200 ng的扇貝作為試驗(yàn)對(duì)象，每種提取試劑做3次平行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，80%甲醇水溶液提取效率明顯優(yōu)于20%甲醇水溶液和50%甲醇水溶液。因此，選擇80%甲醇水溶液作為提取試劑。

表3 提取試劑對(duì)回收率的影響

2.2.5 方法檢出限、回收率及精密度結(jié)果 PbTx-2在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀上最佳響應(yīng)濃度范圍為5，10，20，50，100，200，500 ng/mL，曲線(xiàn)方程y=10 236.300 37x-127 631，相關(guān)系數(shù)0.997 92。在曲線(xiàn)最低點(diǎn)濃度處(5 ng/mL)儀器的信噪比S/N=3，根據(jù)取樣量2 g、稀釋倍數(shù)為4，最終定容體積4 mL，計(jì)算得方法檢出限為40 μg/kg。圖2為20 ng/mL 的PbTx-2標(biāo)準(zhǔn)溶液在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀最佳狀態(tài)下得到的總離子流圖。由圖2可得， PbTX-2的總離子流圖峰形與響應(yīng)良好且噪聲干擾小，能夠滿(mǎn)足檢測(cè)所需。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖20 ng/mL PbTX-2

選擇陰性的扇貝和蛤蜊樣品為空白基質(zhì)，分別在3個(gè)濃度(檢出限、5倍檢出限、參考限量限)添加，每個(gè)濃度做6個(gè)平行樣品，按上述優(yōu)化方法進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算得各添加水平對(duì)應(yīng)的回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可以看出，PbTx-2的平均回收率為82.95%～112.95%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.27%～2.94%。方法的回收率與精密度可滿(mǎn)足PBTx-2的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要求。

表4 回收率和精密度結(jié)果

2.2.6 方法的實(shí)際應(yīng)用 應(yīng)用試驗(yàn)法對(duì)各水產(chǎn)品市場(chǎng)采購(gòu)蛤蜊、扇貝、貽貝、牡蠣4個(gè)品種40份樣品進(jìn)行檢測(cè)，所檢測(cè)樣品中貝類(lèi)毒素的含量均小于方法檢出限。有研究[1]表明，神經(jīng)性貝類(lèi)毒素常見(jiàn)發(fā)生區(qū)域?yàn)槊绹?guó)沿岸、墨西哥灣沿岸和新西蘭沿岸。赤潮雖在中國(guó)沿海有分布，但尚未有檢測(cè)出該毒素樣品的報(bào)道。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了NSP免疫親和柱的制備和NSP毒素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法，通過(guò)研究NSP檢測(cè)方法中免疫親和柱的制備、樣品的提取和凈化、色譜質(zhì)譜條件，達(dá)到了檢測(cè)方法的檢出限低、穩(wěn)定性好、抗干擾能力強(qiáng)、定性定量結(jié)果準(zhǔn)確的效果；彌補(bǔ)了現(xiàn)行國(guó)標(biāo)(GB 5009.261—2016)方法的檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作過(guò)程相對(duì)復(fù)雜和無(wú)法定量等方面的不足。采用試驗(yàn)方法檢測(cè)了4種中國(guó)常見(jiàn)水產(chǎn)品，與相關(guān)文獻(xiàn)[1]檢測(cè)結(jié)果基本相同。