陳宏彬，張炎華，林 琦，修文瓊，翁育偉，謝劍鋒

流行性感冒(Influenza)簡稱流感，是流感病毒引起的一種急性發(fā)熱性呼吸道傳染病。流感病毒是RNA病毒，病毒顆粒的表面有兩種形態(tài)不一、長度均為10～20 nm的糖蛋白突起，即血凝素和神經(jīng)氨酸酶，均具有抗原性。HA及NA易于發(fā)生變異，而且變異是各自獨(dú)立的。B型流感病毒在某些特定的情況下所導(dǎo)致的疾病負(fù)擔(dān)甚至超過A型流感病毒，2013-2014年流感流行季節(jié),在北美地區(qū)特別是美國暴發(fā)了大范圍B型流感疫情[1]。B型流感病毒與A型相比更容易引發(fā)患者發(fā)生并發(fā)癥, 對(duì)兒童、青少年、老人等特定人群易感, 且感染兒童及青少年后引起的病死率較高，給人類的公共衛(wèi)生健康造成了嚴(yán)重威脅[2]。 B型耐藥相關(guān)突變株的突變位點(diǎn)多種多樣，且我國的B型流感病毒耐藥情況與國際情況并不十分一致[3]。而B型流感的多樣性和耐藥病毒株越來越多的涌現(xiàn)可能影響公共衛(wèi)生，有必要對(duì)其研究探討以提供防控參考依據(jù)。

2016年至2017年北半球季節(jié)性流感病毒三價(jià)疫苗推薦毒株：A/California/7/2009 (H1N1)pdm09-like virus; A/Hong Kong/4801/2014 (H3N2)-like virus; B/Brisbane/60/2008-like virus。四價(jià)流感疫苗含兩種B型流感病毒，除上述3種病毒株外，增加的另一種B型流感病毒為B/Phuket/3073/2013-like virus疫苗株。B型流感病毒HA蛋白的抗原決定簇主要包括了4個(gè)區(qū)域分別是120環(huán)(116～137)、150環(huán)(141～150)、160環(huán)(160～172)和190螺旋(194～202)，其中Victoria系的120環(huán)包括了75和77位點(diǎn)[4]。RBS包括190螺旋(193-202)、240環(huán)(237-242)、140環(huán)(136-143)、Phe-95、Trp-158、His-191、Tyr-202[5]。B型流感耐藥位點(diǎn)包括E117G/A/D/V、R150K、D197E/N/Y、I221V/I/T、H273Y、R292K、N294S、R374K、G407S[6-7]。

1 材料和方法

1.1資料及標(biāo)本來源 從中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)采集日期2016年1月1日至2016年12月31日的我省流感監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。毒株來源2016年福建省流感網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測(cè)流感樣病例，犬腎傳代細(xì)胞或雞胚分離培養(yǎng)。

1.2病毒核酸的提取 天隆科技(蘇州)有限公司病毒RNA提取試劑盒。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成引物序列 見表1，生工生物工程(上海)股份有限公司合成。(引物來源：http://gsc.jcvi.org/projects/msc/influenza/)

1.4RT-PCR擴(kuò)增及測(cè)序 TaKaRa Prime Script one step RT-PCR試劑盒。反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 cycles；72 ℃ 10 min。產(chǎn)物測(cè)序由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司完成。

1.5病毒序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建 測(cè)序用SeqMan軟件拼接，并選取WHO推薦的北半球流感疫苗株和代表株多序列排列比對(duì)。Victoria系與北半球流感疫苗株B/Brisbane/60/2008，我國代表株B/Chongqing-Yuzhong/1384/2010; 2006-2007年北半球疫苗株B/Malaysia/2506/2004，2002-2004年北半球疫苗株 B/Hong Kong/330/2001及參照序列 B /Victoria /02/1987(均來自美國 GenBank 數(shù)據(jù)庫)繪制進(jìn)化樹；Yamagata系與2015-2016北半球疫苗株B/Phuket/3073/2013，2013-2015北半球疫苗株B/Massachusetts/2/2012,2012-2013北半球疫苗株 B/Wisconsin /01 /2010， WHO 疫苗種子株 B/Hubei-Wujiagang /158 /2009；北半球2008-2009年疫苗株B /Florida /4 /2006;北半球2005-2006 年疫苗株B /Shanghai /361 /2002；北半球2001-2002年疫苗株 B /Sichuan /379 /99及參照序列B /Yamagata /16 /1988(均來自美國 GenBank 數(shù)據(jù)庫) 繪制進(jìn)化樹。GASID下載2016年其他省份HA、NA序列。MEGA構(gòu)建Neighbor-Joining進(jìn)化樹， Kimura 2-parameter模型繪制核酸系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap設(shè)為1000。Net NGlyc 1.0 Server在線分析軟件預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)。

表1 B型流感病毒NA/HA基因擴(kuò)增引物Tab.1 NA/HA gene amplification primers for influenza B virus

2 結(jié) 果

2.1福建省2016年流感流行情況分析 2016年福建省流感網(wǎng)絡(luò)監(jiān)測(cè)流感樣病例共24 131份，原始標(biāo)本PCR檢測(cè)到流感4 935例；其中Victoria系共1 988例(40.28%)，Yamagata系480例(9.7%)，季H3共1 368例(27.43%)，新甲H1共1 083例(21.95%)。H1N1，H3N2、B型流感交替流行(圖1)，上半年B型為主，H1N1其次，下半年H3N2則成為流行優(yōu)勢(shì)株。B型兩個(gè)譜系同時(shí)流行，冬春季節(jié)為發(fā)病高峰。8～9月B型流感數(shù)量明顯降低，H3N2成為主流。為了解福建省流行的B型流感病毒分子特性，挑取各地市不同時(shí)間段51株流感毒株對(duì)HA、NA基因進(jìn)行分析。

圖1 福建省2016年流感監(jiān)測(cè)不同型別構(gòu)成圖Fig.1 Different types of influenza surveillance in Fujian Province in 2016

2.2HA/NA同源進(jìn)化分析 Victoria系的28株HA和31株NA核苷酸序列與B/Brisbane/60/2008疫苗株同源性分別在98.6%～100%和97.8%～100%。Yamagata系的23株HA和20株NA核苷酸序列與B/PHUKET /3073/2013疫苗株同源性分別在98.3%～100%和97.8%～100%。HA基因進(jìn)化樹分析見圖2，Yamagata系和Victoria系分為2個(gè)分支，我國疫苗株與我省及其他省份毒株在同一分支，距離近，無重配發(fā)生。NA基因進(jìn)化樹圖3也分為Yamagata系和Victoria系，與疫苗株在同一分支上，與同年其他省份距離近在同一分支上，有2株重配株(BY-NA/BV-NA)。2016年流感與早期B型毒株NA距離較遠(yuǎn)，已經(jīng)形成新的分支。

●：vaccine strains and reference sequences； ▲：strains from other provinces of China.圖2 2016年福建省B型流感病毒HA基因進(jìn)化樹Fig.2 Evolution of HA gene of influenza B virus in Fujian Province in 2016

●：vaccine strains and reference sequences； ▲：strains from other provinces of China.圖3 2016年福建省B型流感病毒NA基因進(jìn)化樹Fig.3 Evolution of NA gene of influenza B virus in Fujian Province in 2016

2.3HA變異分析 HA基因變異只顯示抗原決定簇上變異位點(diǎn)(表2、3)。Victoria系與疫苗株B/Brisbane/60/2008相比，HA共有16個(gè)變異位點(diǎn)，大部分毒株存在I117V,N129D,A199T變異，涉及到120環(huán)(117、129)、190螺旋(197，199)也是RBS、150環(huán)(2株)其中RBS(1株)。117位點(diǎn)有4株無變異，而這4株有T189A變異。只1株117,129均無變異，而這株有I146V,K209N變異。Yamagata系與疫苗株B/PHUKET/3073/2013相比，HA共有19個(gè)變異位點(diǎn)，均存在L172Q、M251V變異，大部分毒株存在K211R，涉及到120環(huán)(2株)、150環(huán)(1株)、RBS+190螺旋(2株)； 5株有29(V-A)或275(A-V)變異，無此變異的毒株有K211R變異。

2.4NA變異分析 2016年福建省51株B型流感NA發(fā)現(xiàn)耐藥位點(diǎn)D197N(1株)，余未見耐藥位點(diǎn)。NA酶活性區(qū)域由功能部位8個(gè)氨基酸R-118、D-151、R-152、R-224 、E-276、R-292、R-371和 Y-406 和結(jié)構(gòu)部位11個(gè)氨基酸 E-119、R-156、W-178、S-179、D-198、I-222、 E-227、H-274、E-277、N-294和 E-425(以上位點(diǎn)基于N2編碼)，在A型和B型流感病毒中均為保守氨基酸[8]。NA酶活性區(qū)域或者結(jié)構(gòu)部位發(fā)生構(gòu)象變異的突變會(huì)影響病毒對(duì)NAI的敏感性，51株B型流感1株D198N變異，余未發(fā)現(xiàn)以上活性區(qū)變異。

Victoria系與疫苗株B/Brisbane/60/2008相比，NA共37個(gè)變異位點(diǎn)，I120V,K220N,S295R,N340D,E358K, D384G在大部分毒株存在; Yamagata系與疫苗株B/PHUKET/3073/2013相比NA共27個(gè)變異位點(diǎn)，變異位點(diǎn)零散。除了1株其余都發(fā)現(xiàn)有I49T或A62T位點(diǎn)變異，而沒有2個(gè)位點(diǎn)變異的這株發(fā)生了A67V變異。P100S、I115V兩位不同時(shí)發(fā)生變異或都無變異。類似情況還見于S295R、M403I兩個(gè)位點(diǎn)，除了1株(思明1344)同時(shí)發(fā)現(xiàn)S295R、M403I兩個(gè)位點(diǎn)變異，而這株獨(dú)有G70E、R186K、D235N、I248V、K320D變異，變異位點(diǎn)(9)最多，與疫苗株不在同一分支。

2.5糖基化位點(diǎn)分析 28株Victoria系HA存在25、59、145(抗原決定簇150環(huán))、166(抗原決定簇160環(huán))、197(4株除外，抗原決定簇190螺旋和RBS)、233、304、333、492、518、531、563共11-12個(gè)糖基化位點(diǎn)。與疫苗株相比多1個(gè)糖基化位點(diǎn)197(4株除外)。23株Yamagata系HA存在25、59、145(抗原決定簇150環(huán))、167(抗原決定簇160環(huán))、196(1株除外，抗原決定簇190螺旋和RBS)、303、332、491、517、530、562共10-11個(gè)糖基化位點(diǎn)。與疫苗株一致。29株Victoria系NA存在56、64、144、284共4個(gè)糖基化位點(diǎn)。與疫苗株一致。22株Yamagata系NA存在56、64、144、284、463(2株重配株除外)共4-5個(gè)糖基化位點(diǎn)。與疫苗株一致。

表2 福建省2016年B型Victoria系流感HA基因變異情況Tab.2 Variation of HA gene in influenza B Victoria in Fujian Province in 2016

表3 福建省2016年B型Yamagata系流感HA基因變異情況Tab.3 Variation of HA gene in influenza B Yamagata in Fujian Province in 2016

3 討 論

B型流感和A型一樣受到了很強(qiáng)的人群免疫壓力，病毒依靠外膜蛋白，特別是血凝素重鏈區(qū)(HA1)的變異，來改變抗原特性從而逃避機(jī)體固有免疫[9]。最近流行的病毒包括Victoria和Yamagata兩系相對(duì)熵高的HA殘基最常位于120環(huán)區(qū)域[10]，本文研究中Victoria系毒株HA變異大多數(shù)涉及到120環(huán)，表位區(qū)域外的一些變異位點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。Yamagata和Victoria的HA變異方式不同，Victoria的變異主要涉及到2-3個(gè)抗原決定簇以及RBS，而Yamagata抗原決定簇變異的少,這兩系可能以不同方式進(jìn)行變異累積。

2016年福建省Yamagata系HA的糖基化位點(diǎn)與疫苗株相比只1株少1個(gè)糖基化位點(diǎn)，其他糖基化位點(diǎn)一樣。Victoria系HA的糖基化位點(diǎn)與疫苗株相比只4株沒有增加1個(gè)糖基化位點(diǎn)。HA糖基化位點(diǎn)的增減及位置變化，HA上糖鏈結(jié)構(gòu)、數(shù)量的變化以及受體結(jié)合位點(diǎn)附近糖鏈的修飾等不僅對(duì)病毒的增殖、毒力產(chǎn)生影響，還會(huì)影響病毒與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合能力等[11]。病毒在進(jìn)化過程中也會(huì)獲得新的糖基化位點(diǎn)，這些新積累的糖基化位點(diǎn)可能會(huì)掩蓋抗原位點(diǎn)，成為病毒逃避宿主免疫壓力的一種方式[12]。Victoria系增加的糖基化位點(diǎn)可能是2016年Victoria系在福建省流感中占多數(shù)的原因之一。

目前，一線抗流感病毒藥物神經(jīng)氨酸酶抑制劑已在臨床上廣泛上使用，甲型和乙型流感病毒對(duì)臨床上常用的耐藥率并不高(保持在2%以內(nèi)[13])，但亦有研究表明耐藥株容易在兒童、65歲以上老人和免疫功能低下者體內(nèi)分離出[14]。51株B型流感病毒均未發(fā)現(xiàn)以上活性區(qū)變異，只1株耐藥株，其他50株敏感提示我省B型流感對(duì)NAI的敏感性未發(fā)生明顯改變，可推測(cè)福建省目前流行B型流感對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物敏感。國家疾控中心推斷目前我國流行的B型流感毒株對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物敏感[15]，與本研究結(jié)論一致。雖然B型流感的2個(gè)種系在進(jìn)化上存在差異，但二者可在人群中同時(shí)流行增加發(fā)生基因重配的機(jī)會(huì)。從進(jìn)化樹上看重配的病毒與疫苗株距離較遠(yuǎn)，重配是否影響B(tài)型流感病毒的生長特性、毒力等需進(jìn)一步的研究。

在抗原決定簇區(qū)外的一些位點(diǎn)也發(fā)生了變異，除了目前已知的抗原決定簇區(qū)域可能還存在其他的變異區(qū)[9]。變異如何影響病毒的抗原性需進(jìn)一步研究，增加對(duì)流感病毒進(jìn)化規(guī)律的認(rèn)識(shí)能幫助我們更好的有效預(yù)防和治療。多方研究報(bào)道均提示病毒蛋白上的一些位點(diǎn)在進(jìn)化過程中會(huì)相互聯(lián)系、相互協(xié)同；一種簡單的情形就是：同一個(gè)蛋白一對(duì)正選擇位點(diǎn)在插曲式的正選擇作用下，或者保持穩(wěn)定，或者同時(shí)突變(如 PB1 蛋白52 位于 576 位)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)的一些變異位點(diǎn)可為研究其功能相關(guān)性提供基礎(chǔ)。

有研究表明一旦H3N2病毒離開東南亞地區(qū)，病毒就無法進(jìn)行長期的進(jìn)化，假如流行病毒是有規(guī)律的從外地輸入，如果種子株輸入源可以確認(rèn)，就可能預(yù)測(cè)出哪個(gè)變異株將在流行區(qū)域出現(xiàn)，而隨之優(yōu)化疫苗株的選擇[17]。國家疾控中心提示BY系個(gè)別位點(diǎn)變異主要來自福建省，多數(shù)低反應(yīng)毒株分離自南方省份，要高度關(guān)注南方省份Yamagata系病毒的抗原性和基因特性變異情況[18]。進(jìn)化樹圖可看出我省與其他省份的毒株并不能區(qū)分開，可能為同一個(gè)傳染源。大部分B型流感同源性高差異不明顯，但仍有個(gè)別株差異較大。由于個(gè)體中流感免疫反應(yīng)的復(fù)雜性與多次暴露于不同毒株有關(guān)，不同接觸史的宿主可能會(huì)繼續(xù)經(jīng)歷不同的感染模式，這可能會(huì)影響流感病毒持續(xù)的抗原進(jìn)化[19]。推測(cè)HA的單適應(yīng)性突變也與近幾年疫苗效果不佳有關(guān)，而NA基因未受疫苗的影響或許可為下一代疫苗即構(gòu)建一個(gè)同時(shí)含有可表達(dá)HA和NA蛋白的重組株的研究提供參考[20]。因此本文分析2016年福建省B型流感病毒HA和NA變異特征為我省疫情防控提供參考依據(jù)。

利益沖突：無

引用本文格式：陳宏彬，張炎華，林琦，等.2016年福建省B型流感病毒基因特征分析[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2020，36(2)：118-123,157. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.176