王鳳婷 張?chǎng)紊? 潘洪玉 劉金亮

摘要?以小白菜、菠菜和生菜為實(shí)驗(yàn)材料，研究改良研磨法與浸提法在葉綠素提取定量測(cè)定中的應(yīng)用，分析不同提取時(shí)間對(duì)葉綠素提取效果的影響。結(jié)果表明，改良研磨法操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短、重復(fù)性好，且適用于不同植物材料，適合于大學(xué)生實(shí)驗(yàn)教學(xué)。浸提法操作非常簡(jiǎn)單、安全，只是實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)提取速度受較多因素的影響。

關(guān)鍵詞?葉綠素，實(shí)驗(yàn)教學(xué)，提取方法，蔬菜

中圖分類號(hào)?S-3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2020）06-0001-03

Abstract?Using Chinese cabbage， spinach and lettuce as experimental materials， this paper studied the application of ?the improved grinding method and the extraction method in chlorophyll extraction， and analyzed the effects of different extraction time on the chlorophyll extraction.The results showed that the improved grinding method was simple to operate，took a shorter time， and the repeatability was good. It was suitable for different plant materials and suitable for experimental teaching. The extraction method was very simple， but it took a long time， and its extraction speed was affected by many factors.

Key words?Chlorophyll，Experimental teaching，Extraction method，Vegetables

葉綠素含量是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要生理指標(biāo)之一，其功能主要為吸收、傳遞光量子，進(jìn)而影響 PSII、PSI之間能量的合成與轉(zhuǎn)換，影響凈光合速率，因此葉綠素含量與植物的光合作用、營(yíng)養(yǎng)狀況、生理狀態(tài)等密切相關(guān)[1-2]。葉綠素含量無(wú)論是在品種選育還是植物抗性、生理狀態(tài)方面都是重要的研究指標(biāo)[3-4]。

葉綠素含量的測(cè)定是高等院校農(nóng)學(xué)相關(guān)專業(yè)植物生理學(xué)課程的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)。目前關(guān)于不同植物葉綠素提取與含量測(cè)定的方法研究較多，常用的提取溶劑主要是乙醇、丙酮或二者的混合液，提取方法分為研磨和浸提2種。傳統(tǒng)的研磨方法是植物材料經(jīng)過研磨、過濾、定容后再進(jìn)行比色測(cè)定，整個(gè)過程繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)，操作中還易受光氧化的破壞，導(dǎo)致誤差較大[5]。浸提法采用溶劑浸泡葉片的方法將葉綠素萃取出來，然后進(jìn)行比色測(cè)定[6]。直接浸提法，雖然方法簡(jiǎn)單易行，免除了研磨提取中的繁瑣手續(xù)，但不同植物葉綠體色素提取速度不同，最佳的提取時(shí)間和溫度要求也不同[7]。

為了培養(yǎng)與提高大學(xué)生的科研創(chuàng)新技能，在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中加大了設(shè)計(jì)性與綜合性實(shí)驗(yàn)的比例，其中葉綠素的提取與測(cè)定是這類實(shí)驗(yàn)中常涉及到的一項(xiàng)內(nèi)容。由于實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目?jī)?nèi)容較多且學(xué)生操作技能不熟練，在有限的課堂時(shí)間內(nèi)難以完成。為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)教學(xué)步驟、節(jié)省時(shí)間、提高效率，篩選一個(gè)快速、無(wú)耗損且提取率高的實(shí)驗(yàn)方法具有非常重要的意義。鑒于本科生實(shí)驗(yàn)受管制的藥品較多（如丙酮、DMSO等），筆者選擇安全性高的乙醇試劑為提取液，通過測(cè)定葉菜類蔬菜小白菜、菠菜、生菜的葉綠素含量，探索出適合實(shí)驗(yàn)教學(xué)的安全、高效、簡(jiǎn)單易操作的葉綠素提取方法。

1?材料與方法

1.1?材料、試劑與主要儀器

供試材料為小白菜、菠菜和生菜，均為人工氣候室種植，新鮮度一致。試劑為分析純乙醇（95%）。主要儀器包括紫外可見分光光度計(jì)（UV2100）、高速冷凍離心機(jī)（eppendorf-AG）、萬(wàn)分之一天平（ 梅德勒）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9082）、海爾冰箱。

1.2?提取方法

1.2.1?浸提法。

選取多片葉位一致的葉片，洗凈，用吸水紙吸凈葉片水分，避開主葉脈剪成2 mm 的細(xì)條，混勻后分別稱取細(xì)條0.2 g放入具塞試管中，加入95%乙醇提取液中浸提，加塞遮光。浸提時(shí)間分別為2、3、4、5、6、7和24 h，提取溫度分別為4、25和40 ℃。將提取液搖勻后分別于波長(zhǎng) 665和 649 nm 下測(cè)定吸光度，重復(fù)3次。

由于葉綠素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用不同溶劑提取色素時(shí)，計(jì)算公式也有不同。葉綠素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波長(zhǎng)分別為665和649 nm，計(jì)算公式[8]：

組織中色素含量的計(jì)算（mg/g 鮮重）：

1.2.2?改進(jìn)的研磨法。

選取多片葉位一致的葉片，洗凈，用吸水紙吸凈葉片水分，并剪成 2 mm 的細(xì)條，混勻后分別稱取細(xì)條0.2 g放入研缽中，加入少量 95%乙醇研磨提取，充分研磨后移入25 mL容量瓶中，用95%乙醇充分洗滌研缽和研棒，最后定容。提取液分別靜置10、20、30、40、50、60 mim后轉(zhuǎn)至離心管中離心5 min，轉(zhuǎn)速6 000 r/min，取上清進(jìn)行定量分析。測(cè)定計(jì)算方法同“1.2.1”。

改進(jìn)的研磨法是通過離心代替了傳統(tǒng)研磨法中的過濾步驟，縮短了時(shí)間，減少了葉綠素在提取過程中的降解[9]。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同提取溫度和時(shí)間下葉綠素的浸泡提取

小白菜葉綠素40 ℃下提取時(shí)，發(fā)現(xiàn)浸提6 h后提取量無(wú)顯著差異，說明在40 ℃下提取6 h可達(dá)到較好的提取效果。在20 ℃和4 ℃下提取時(shí)，提取速度較慢，提取時(shí)間增加至24 h才能達(dá)到較好的效果。葉綠素b在40 ℃下提取浸提6 h后無(wú)顯著差異，20 ℃和4 ℃下提取7 h與24 h無(wú)顯著差異，這可能與葉綠素b的含量較少提取時(shí)間較短有關(guān)（圖1）。

菠菜葉綠素提取時(shí)，提取時(shí)間在2～7 h提取溫度高提取速度快，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)提取量逐漸增大，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到24 h，不同溫度之間提取效果無(wú)顯著差異，均能提取完全。這說明短時(shí)間浸泡提取中，適當(dāng)高溫可以增加葉綠素提取速度（圖2）。

生菜葉綠素提取時(shí)，不同提取溫度和時(shí)間下葉綠素提取量無(wú)顯著差異，不同溫度下提取7 h時(shí)均能達(dá)到較好的提取效果，但當(dāng)提取時(shí)間長(zhǎng)至24 h時(shí)，葉綠素含量有降低趨勢(shì)。表明溫度對(duì)生菜葉綠素提取速度影響不顯著，這可能與生菜的葉片薄、葉綠素含量少比較容易提取有關(guān)。當(dāng)提取時(shí)間長(zhǎng)至24 h時(shí)，不同提取溫度下的葉綠素含量均有下降，說明葉綠素有一定的降解（圖3）。

2.2?改進(jìn)的研磨法提取葉綠素

研磨法提取3種蔬菜的葉綠素時(shí)，提取時(shí)間小于20 min時(shí)，葉綠素未提取完全，隨著提取時(shí)間的增加提取量逐漸增大，當(dāng)提取時(shí)間在20～40 min時(shí)，葉綠素提取量無(wú)顯著差異，而當(dāng)提取時(shí)間長(zhǎng)于40 min后，提取量有下降趨勢(shì)，說明葉綠素有不同程度的降解。小白菜、菠菜和生菜的研磨提取中，由于葉片組織均被破碎，三者在提取時(shí)間上無(wú)差異（圖4～6）。

2.3?葉綠素2種提取方法的比較

采用乙醇浸泡提取和乙醇研磨提取2種方法分別對(duì)葉菜類蔬菜小白菜、菠菜和生菜葉片葉綠素進(jìn)行了提取、測(cè)定分析。結(jié)果表明，小白菜葉綠素40 ℃下提取6 h可以達(dá)到較好的提取效果，若提取溫度較低，則需要延長(zhǎng)提取時(shí)間，研磨法提取20 min則能充分提取，與40 ℃下浸泡提取6 h結(jié)果無(wú)顯著差異，均能達(dá)到較好的效果。

菠菜葉綠素在較短的浸泡提取時(shí)間內(nèi)不能充分提取，在4～40 ℃下提取時(shí)均需提取約24 h達(dá)到較好的效果，故提取時(shí)間較長(zhǎng)，而研磨法提取僅需要研磨后靜置20 min即可達(dá)到好的提取效果，與浸泡提取的最大值無(wú)顯著差異。

生菜葉綠素浸泡提取時(shí)，溫度對(duì)其提取速度的影響不明顯，浸泡提取7 h測(cè)定值達(dá)到最大，研磨法提取同樣需研磨后靜置20 min，其測(cè)定值與浸泡提取最大值無(wú)差異。

綜合上述結(jié)果表明，乙醇在對(duì)葉菜類的葉綠素提取中，浸提法與研磨法均可取得良好效果，不同的是浸泡提取需要時(shí)間較長(zhǎng)，不同的提取材料需要的適宜溫度與浸提時(shí)間不同，比較適宜于處理大量樣品，而研磨法則提取時(shí)間短，操作相對(duì)浸提法復(fù)雜，適宜處理少量樣品。

3?討論

通過對(duì)3種蔬菜葉綠素提取方法和時(shí)間的比較發(fā)現(xiàn)，浸泡提取葉綠素時(shí)，小白菜40 ℃下提取6 h測(cè)定量較高，提取較充分，菠菜在不高于40 ℃的溫度下提取時(shí)，提取時(shí)間增加至24 h才可以提取充分，生菜受溫度的影響不顯著，提取時(shí)間7 h提取量最高。因此，不同的植物材料采用浸提法提取葉綠素時(shí)，最佳的提取時(shí)間、提取溫度不同，這與徐瀾等[7]的研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)小麥、冬青菠菜、油菜葉綠素的提取量最高時(shí)處理溫度分別為 40、40、60、50 ℃，處理時(shí)間分別為 36、12、1.5、4.5 h。

浸泡提取時(shí)，生菜葉綠素提取值在提取7 h后有下降趨勢(shì)，這可能與葉綠素的降解有關(guān)，而小白菜與菠菜提取時(shí)，由于提取速度較慢葉綠素的提取速率大于降解速率，故提取值無(wú)下降趨勢(shì)。這說明葉綠素提取充分以后，要盡快進(jìn)行含量測(cè)定，以防葉綠素降解導(dǎo)致測(cè)定值偏小。同時(shí)也表明葉綠素提取速度除受溫度、時(shí)間影響外，還與樣品的結(jié)構(gòu)有關(guān)。浸泡提取葉綠素的速度一定程度上還受處理樣品大小、提取液與樣品比例的影響，適當(dāng)?shù)匕褬悠贩鬯榛蛟黾犹崛∫旱牧坑兄谔岣咛崛∷俣萚10-13]。

該研究中，用改進(jìn)的研磨法對(duì)3種葉菜類蔬菜的葉綠素進(jìn)行了測(cè)定，均表現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)，在研磨后靜置20～40 min時(shí)，葉綠素測(cè)定值較高，此時(shí)間內(nèi)葉綠素的降解較少，對(duì)測(cè)定值影響不顯著。此方法避免了傳統(tǒng)研磨法中的濾紙過濾速度慢、時(shí)間長(zhǎng)、葉綠素受光氧化破壞使測(cè)定值偏低的缺點(diǎn)，具有快速、簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，不受樣品特性、溫度、時(shí)間、提取液與樣品比例等因素的影響，使用范圍較廣。

4?結(jié)論

2種葉綠素提取方法均采用乙醇為提取液，該試劑無(wú)毒、無(wú)腐蝕性，安全系數(shù)較高，比丙酮、甲醇、DMSO[14-15]等更適合用于本科生教學(xué)實(shí)驗(yàn)。改進(jìn)的研磨法操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短、重復(fù)性好，一個(gè)樣品完成實(shí)驗(yàn)僅需0.5 h左右，而且適用于不同的植物材料，這大大節(jié)省了課堂時(shí)間。浸泡提取法操作十分簡(jiǎn)單，只是實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)提取速度受較多因素影響，在樣品較少、工作量不大時(shí)不宜使用。

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