褚文麗，陳水齡，亢澤峰，劉健，李維義，陶方方

人參皂苷Rg3（ginsenoside，Rg3）是人參生物活性和藥理作用的主要藥效成分之一，具有抗腫瘤、抗血管生成、提高機體免疫力等藥理作用，單用Rg3即可抑制腫瘤的血管生成，和化療藥聯(lián)合應用具有增效的作用，被廣泛應用于腫瘤的臨床治療[1-2]。Rg3成藥“參一膠囊”是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準上市的腫瘤新生血管抑制劑，適用于肺癌、胃癌、結(jié)腸癌及食道癌等多種惡性腫瘤[3-4]。大量研究顯示Rg3 同樣能夠抑制眼部新生血管的生成，且應用及研究多集中角膜和視網(wǎng)膜[5-6]，僅有少量研究證實其對脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）生成具有抑制作用[7]。本研究以RF/6A 細胞為研究對象，通過采用體外促血管生成因子-血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）刺激培養(yǎng)RF/6A 細胞，誘導其增殖，予以人參皂苷Rg3 進行干預，觀察Rg3 對其增殖和移行的影響，探討評價人參皂苷Rg3 對CNV 形成的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），胎牛血清FBS（美國Gibco 公司），0.25%胰蛋白酶（美國Gibco 公司），二甲基亞砜DMSO（美國Amresco 公司），PBS 磷酸鹽緩沖液（北京索萊寶科技有限公司），青鏈霉素（北京源博匯科技術(shù)研究所），CCK-8 試劑盒（日本同仁化學研究所），重組人VEGF165 蛋白（美國PEPROTECH 公司，AF100-20），0.4%臺盼藍染色液（北京索萊寶科技有限公司），4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司），0.1%草酸銨結(jié)晶紫染色液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器 5% CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific，美國），全自動酶標儀（Thermo，美國），熒光倒置顯微鏡（Olympus，IX81），超凈工作臺（西安永樂精密機械有限公司），臺式高速離心機（Eppendorf，德國），4℃離心機（德國），精密電子天平（AUW220，SHIMADZU），細胞計數(shù)板（上海求精生化試劑儀器有限公司），-80℃冰箱（SANYO，日本），恒溫水浴鍋（AISETYLJYE-100，上海亞泰儀表有限公司）。

1.1.3 材料和藥品RF/6A 細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：人參皂苷Rg3（中國食品藥品檢定研究院，ID：F0Z7-Z25D），康柏西普眼用注射液（成都康弘藥業(yè)，批號：S20130012）；Rg3 溶液配制：將Rg3 粉劑溶于DMSO，配制成終濃度為50 mmol/L 的母液，分裝后于4℃保存?zhèn)溆谩ＥR用前用DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基將母液稀釋到所需濃度，DMSO 終濃度不超過0.01%?？蛋匚髌杖芤号渲疲号R用前用DMEM 培養(yǎng)基將其稀釋所需濃度。VEGF165 配制：將VEGF165 粉劑溶于無菌水，配置成0.1 mg/ml 母液，-20℃保存?zhèn)溆?。臨用前用10%FBS 將母液稀釋到一定濃度，再用DMEM 培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.2 方法

1.2.1 RF/6A 細胞的培養(yǎng) 將RF/6A 細胞接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入5%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況，每3～4 d 傳代1 次。取對數(shù)生長期的RF/6A 細胞進行消化、重懸、計數(shù)，用于實驗。

1.2.2 CCK-8 法檢測不同濃度VEGF 對RF/6A 細胞增殖的作用 取對數(shù)生長期的RF/6A 細胞，以1×105/ml密度接種于96 孔板，每孔200 μl，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓12 h 后棄培養(yǎng)基，分別加入20 μl 終濃度為0、10、25、50、100 ng/ml VEGF 和180 μl 完全培養(yǎng)基，另設(shè)空白細胞孔（只有完全培養(yǎng)基），每個濃度設(shè)3 個復孔，分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h 和72 h 后，每孔加入CCK-8 溶液20 μl，繼續(xù)孵育4 h 后置酶標儀上，在450 nm 波長處測定每孔的吸光度值（OD 值）。

1.2.3 CCK-8 法檢測不同濃度康柏西普對VEGF刺激RF/6A 細胞增殖的影響 實驗方法同1.2.2，VEGF 干預濃度50 ng/ml，康柏西普干預濃度分別為0.5、1.5、4.5、13.5、40.5 ug/ml，作用時間為48 h。觀察不同濃度康柏西普對VEGF 誘導的RF/6A 細胞增殖的影響，選擇康柏西普的最佳抑制作用濃度，用于后續(xù)實驗。

1.2.4 CCK-8 法檢測不同濃度Rg3 對VEGF 刺激的RF/6A 細胞增殖的影響 細胞常規(guī)接種饑餓后棄培養(yǎng)基，根據(jù)分組分別加入最佳刺激濃度VEGF 以及不同濃度的Rg3 和康柏西普，補足完全培養(yǎng)基，其分組依次為：（1）正常細胞組RF/6A 細胞正常培養(yǎng)；（2）VEGF 組RF/6A 細胞+VEGF；（3）康柏西普組RF/6A 細胞+VEGF+康柏西普組；（4）Rg3 低濃度組RF/6A 細胞+VEGF+Rg3 低濃度；（5）Rg3 中濃度組RF/6A 細胞+VEGF+Rg3 中濃度；（6）Rg3 高濃度組RF/6A 細胞+VEGF+Rg3 高濃度；每組設(shè)3 個復孔，分別培養(yǎng)48 h 后，每孔加入CCK-8 溶液20 μl，繼續(xù)孵育4 h 后置酶標儀上，在450 nm 波長處測定每孔的吸光度值（OD 值）。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測Rg3 及康柏西普對VEGF刺激RF/6A 細胞移行的影響 細胞以1×105/ml 密度接種到于24 孔板，每孔體系為2 ml，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，棄上清，加入DMEM 高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將無菌直尺放在24 孔板表面，用20 μl 微量加樣槍頭垂直于24 孔板，在板孔低均勻行“|”形劃痕制作損傷劃痕。劃痕后用PBS 沖洗2～3 遍，以去除脫落懸浮的細胞，加入無DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基于顯微鏡下拍照記錄（此時為0 h）。拍照后，根據(jù)實驗分組分別加入10 μl最佳刺激濃度VEGF165 及10 μl Rg3 或康柏西普，具有實驗分組依次為：（1）正常細胞組：細胞正常培養(yǎng)；（2）VEGF 組：RF/6A 細胞+VEGF；（3）康柏西普組：RF/6A 細胞+VEGF+康柏西普組；（4）人參皂苷Rg3 組：RF/6A 細胞+VEGF+Rg3；（5）聯(lián)合組：RF/6A細胞+VEGF+康柏西普+Rg3；繼續(xù)孵箱培養(yǎng)24 h、48 h后，倒置顯微鏡下觀察并記錄各孔細胞向劃痕區(qū)域遷移情況，測量劃痕裸區(qū)（細胞未覆蓋區(qū)）的寬度，即損傷一側(cè)邊緣到另一側(cè)邊緣的寬度，邊緣的界定是以移行離開初始劃行線最遠而又和其他細胞相連的細胞為準。利用Image-Pro Plus 軟件測量并計算遷移率。遷移率=（L0-Lt）/L0×100%（L0：起始劃痕裸區(qū)寬度，Lt：各時間點劃痕裸區(qū)寬度）。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 20.0 軟件和Graphpad Prism 5.0 進行統(tǒng)計分析和做圖，計量資料用均值±標準差表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RF/6A 細胞形態(tài)

于倒置顯微鏡下觀察，RF/6A 細胞貼壁生長，呈扁平梭狀或多角形狀，大小形態(tài)較為均勻一致（圖1）。細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)1 d 后，可見細胞80%融合，生長旺盛，繼續(xù)培養(yǎng)3 d 后，可見細胞狀態(tài)匯合至90%，排列規(guī)則，本次實驗所用RF/6A 細胞為復蘇后傳代至第3～5 代細胞。

2.2 不同濃度VEGF 對RF/6A 細胞增殖的作用

CCK-8 法檢測顯示，各組OD 值比較，在12 h時間點，不同濃度VEGF 干預培養(yǎng)RF/6A 細胞OD值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在24 h 時間點，50、100 ng/ml 組OD 值均與正常組比較有統(tǒng)計學意義（t=3.217，P=0.032；t=3.538，P=0.024），組間比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），余各組與正常組比較，均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在48 h 時間點，比較有統(tǒng)計學意義（F=6.480，P=0.004），其中25、50 ng/ml 組OD 值與正常組比較有統(tǒng)計學意義（t=5.755，P=0.005；t=7.798，P=0.001），且50 ng/ml 組細胞增值率（1.50±0.134）明顯高于25 ng/ml 組（1.14±0.104），而100 ng/ml 組與正常組比較，OD 值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在72 h時間點，各組OD 值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可能和細胞培養(yǎng)時間較久，細胞自身的增殖有關(guān)。因此，確定50 ng/ml 作為后續(xù)VEGF 干預最佳濃度，作用時間點選為48 h（表1）。

表1 不同濃度VEGF 對RF/6A 細胞增殖的作用（OD 值，±s，n=3）

表1 不同濃度VEGF 對RF/6A 細胞增殖的作用（OD 值，±s，n=3）

注：* 與正常組比較，P＜0.05；▲與25 ng/mL 組比較，P＜0.05

2.3 不同濃度康柏西普對VEGF 誘導RF/6A 細胞增殖作用的影響

CCK-8 法檢測結(jié)果顯示，各組OD 值存在差異（F=13.066,P=0.000），有統(tǒng)計學意義。其中，VEGF 組較正常組OD 值顯著增加（t=9.534，P=0.001），加入不同濃度康柏西普干預后，各組OD 值較VEGF 組均有降低（t 值依次為：-3.147,-3.709，-4.538，-10.854，-11.101，P值依次為0.035，0.021，0.011，0.000，0.000），說明康柏西普能夠抑制VEGF 誘導的RF/6A細胞增殖。0.5、1.5、4.5 μg/ml 康柏西普組間比較，OD值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。13.5 和40.5 μg/ml 組OD 值低于正常組（P 值分別為0.04、0.00），因此，我們選擇0.5 μg/ml 康柏西普作為陽性對照藥物濃度用于后續(xù)實驗（表2）。

表2 康柏西普對VEGF 誘導RF/6A 細胞增殖作用的影響（OD 值，±s，n=3）

表2 康柏西普對VEGF 誘導RF/6A 細胞增殖作用的影響（OD 值，±s，n=3）

注：* 與正常組比較，P＜0.05；▲與單純VEGF 組，P＜0.05

2.4 不同濃度Rg3 對VEGF 誘導的RF/6A 細胞增殖作用的影響

VEGF 誘導RF/6A 細胞增殖后，分別加入低、中、高濃度Rg3 和康柏西普，CCK-8 法檢測結(jié)果顯示，各組間OD 值比較存在統(tǒng)計學差異（F=26.546,P=0.000）。與正常組比較，VEGF 組OD 值明顯增高（t=8.432，P=0.001），藥物干預各組與VEGF 組比較，OD 值均有降低（t 值依次為-7.800，-4.149，-5.653，-6.952；P 值依次為0.001、0.014、0.005、0.002），其OD值從大到小依次10 μmol/L Rg3 組（0.893±0.068）、30 μmol/L Rg3 組（0.887±0.019）、90 μmol/L Rg3 組（0.827±0.022）和康柏西普組（0.756±0.041），可見，低、中、高濃度Rg3 均對VEGF 誘導RF/6A 細胞增殖具有抑制作用，并選擇90 μmol/L 最強抑制濃度作為Rg3 作用濃度用于后續(xù)實驗（表3）。

表3 人參皂苷Rg3 對VEGF 誘導RF/6A 細胞增殖作用的影響（OD 值，±s，n=3）

表3 人參皂苷Rg3 對VEGF 誘導RF/6A 細胞增殖作用的影響（OD 值，±s，n=3）

注：* 與正常組比較，P＜0.05；▲與VEGF 組比較，P＜0.05；※與30 μmol/L Rg3 組比較，P＜0.05

2.5 細胞劃痕實驗結(jié)果

移液槍劃痕后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各組細胞遷移率比較有統(tǒng)計學意義（F=65.891,P=0.000），其中VEGF組顯著高于正常組（t=14.049，P=0.000），藥物干預組低于VEGF 組（t 值依次為-9.226，-3.286，-8.329；P 值依次為0.00、0.030、0.001），聯(lián)合組與康柏西普組遷移率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但均低于Rg3 組（t=4.639，P=0.010；t=4.350，P=0.012），可見聯(lián)合組和康柏西普組抑制細胞遷移力作用較強，人參皂苷組次之。劃痕處理48 h，各組細胞遷移率比較有統(tǒng)計學意義（F=29.584,P=0.000），VEGF 組顯著高于正常組（P＜0.05），藥物干預組顯著低于VEGF 組（P＜0.05），聯(lián)合組低于康柏西普組和Rg3 組（t=8.543，P=0.001；t=3.067，P=0.037）。而康柏西普和人參皂苷Rg3 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖2，表4）。

圖2 劃痕實驗觀察人參皂苷Rg3 對細胞遷移能力的影響（×40）。A 正常組；B VEGF 組；C VEGF+康柏西普組；D VEGF+Rg3；E VEGF+康柏西普+Rg3

表4 人參皂苷Rg3 對VEGF 誘導RF/6A 細胞移行的影響（遷移率，±s，n=3）

表4 人參皂苷Rg3 對VEGF 誘導RF/6A 細胞移行的影響（遷移率，±s，n=3）

注：* 與正常組比較，P＜0.05；▲與VEGF 組比較，P＜0.05；※ 與Rg3（24 h）組比較，P＜0.05；# 與康柏西普(24 h)組比較，P＞0.05；&與Rg3（48 h）組比較，P＜0.05

3 討論

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）已成為我國50 歲以上人群致盲的重要病因之一[5-6]，且隨著社會老齡化進程的不斷加快，AMD 患病率逐年增高[7]。AMD 可分為干性和濕性兩類，濕性AMD 是導致AMD 人群視力損害的主要原因。CNV 是濕性AMD 的特征性改變，是由多種因素共同作用，致視網(wǎng)膜色素上皮-Bruch 膜-脈絡膜新生血管復合體發(fā)生病理性改變而形成。促血管生成因子和血管抑制因子平衡的破壞被認為是血管生成的關(guān)鍵因素，VEGF 是目前發(fā)現(xiàn)促新生血管形成功能最強因子之一，在血管內(nèi)皮細胞移行中起關(guān)鍵作用[8]。

玻璃體腔注射抗VEGF 藥物是目前濕性AMD的一線治療方法，但存在注射頻率高、部分患者對藥物應答延遲或不應答等局限性[9]，中醫(yī)中藥對該病的認識悠久，將其歸屬“視瞻昏渺”“視直如曲”“暴盲”等范疇，治療經(jīng)驗豐富[10-12]?？簼煞逭J為CNV 屬“敗絡”范疇，是內(nèi)邪日久化生內(nèi)毒，毒濁目絡而致絡道亢進，異生血絡（新生血管）[1]，臨床化裁總結(jié)“加減駐景方”療效顯著[14-15]。

CNV 的發(fā)生發(fā)展受多種細胞的調(diào)控，如內(nèi)皮細胞、周細胞、巨噬細胞等，這些細胞被激活后，釋放細胞因子，調(diào)控血管生成。內(nèi)皮細胞啟動血管生成過程，主要包括血管內(nèi)皮細胞出芽、增殖、遷移、分化、血管網(wǎng)形成等[16]，抑制血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移可以抑制血管生成。RF/6A 細胞和人類眼底血管內(nèi)皮細胞具有高度同源性，是目前研究CNV 性疾病最常用細胞之一[17]，因此本部分實驗以RF/6A 細胞為研究對象，通過外源性加入VEGF 模擬體內(nèi)高VEGF 病理狀態(tài)，初步觀察藥物Rg3 及康柏西普對其增殖和遷移的影響，從而為Rg3 干預CNV 形成的作用研究奠定體外實驗基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的VEGF 刺激具有促進RF/6A 細胞增殖的作用，這和手術(shù)取出的CNV 膜標本存在VEGF 高表達相符。該研究中，50 ng/ml VEGF 促進作用最強，最佳作用時間為刺激作用48 h?？蛋匚髌帐俏覈讉€自主研發(fā)并已獲得SFDA 批準用于臨床的一種新型受體融合蛋白抗VEGF 藥物，本研究顯示0.5 μg/ml 康柏西普即有抑制VEGF 誘導RF/6A 細胞增殖作用，因此，選擇0.5 μg/ml 康柏西普作為陽性對照藥物。通過分別給予低、中、高濃度Rg3 干預VEGF 誘導后的細胞，觀察對其增殖的影響發(fā)現(xiàn)，Rg3 對VEGF 誘導RF/6A 細胞增殖具有抑制作用，且在90 μmol/L 高濃度時抑制作用最強。細胞遷移率與細胞遷移能力成正比，遷移率越大，則藥物干預對細胞遷移抑制作用越弱。本研究中細胞劃痕實驗檢測結(jié)果顯示，VEGF 誘導能夠明顯促進RF/6A 細胞遷移，遷移率最大。Rg3 和康柏西普分別干預后，其抑制作用從高到低依次為聯(lián)合組、康柏西普組和Rg3 組，可見，Rg3 對VEGF 誘導后RF/6A細胞增殖和遷移的影響是同向的。

綜上所述，人參皂苷Rg3 和康柏西普均能夠有效抑制VEGF 誘導RF/6A 的細胞增殖與遷移，且聯(lián)合組抑制作用最強。本研究為人參皂苷Rg3 可能作為有效抑制CNV 的潛在藥物奠定了實驗基礎(chǔ)，但本實驗為體外實驗，尚需要進一步體內(nèi)實驗加以證明。