王 偉,劉 云,余華順,戴秋紅,姚 鵑,龔大春*

(1.三峽大學 湖北省生物酵素工程技術研究中心，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司酶制劑事業(yè)部，湖北 宜昌443002)

利用生物催化劑羰基還原酶合成各種手性羥基藥物中間體具有巨大的工業(yè)應用價值。如，羰基還原酶可以高效合成淋巴瘤新藥依魯替尼(Imbruvica)的藥物活性成分的關鍵手性中間體(S)-1-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶[(S)-N-Boc-3-hydroxypiperidine，(S)-NBHP][1]；合成羥甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)還原酶抑制劑他汀類藥物，如阿托伐他汀(Atorvastatin)的手性藥物對映純中間體的前體(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯[(S)-CHBE][2]；合成新型選擇性膽固醇吸收抑制劑依澤替米貝(Ezetimibe)的重要手性中間體的手性側鏈[3]等。這些具有工業(yè)應用前景的合成路線若能找到在工業(yè)生產中大量應用的生物催化劑，可以使生產過程更加綠色環(huán)保。

近平滑假絲酵母ATCC 7330在整細胞催化應用上性能特別優(yōu)異。Chadha課題組[4-8]對近平滑假絲酵母ATCC 7330的整細胞催化應用進行了詳細報道，并對其在手性化合物不對稱合成方面的應用給予了高度肯定；龔大春教授團隊[9]也對近平滑假絲酵母ATCC 7330進行了相關報道。但關于近平滑假絲酵母ATCC 7330中游離羰基還原酶的分離工藝一直未取得突破，限制了其應用。

目前，國內對近平滑假絲酵母ATCC 7330中羰基還原酶的雙水相萃取鮮有報道。鑒于此，作者對聚乙二醇(PEG)和硫酸銨組成的雙水相體系萃取近平滑假絲酵母ATCC 7330中羰基還原酶的工藝進行研究，以期為近平滑假絲酵母ATCC 7330中羰基還原酶更好地應用于不對稱氧化還原反應合成各種手性化合物奠定基礎。

1 實驗

1.1 菌株、試劑與儀器

近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)ATCC 7330，實驗室保藏。

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、麥芽浸粉、蔗糖，北京奧博星生物技術有限責任公司；(NH4)2SO4、磷酸、PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000，國藥集團化學試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

VS-1300L-U型超凈工作臺，蘇凈安泰；UV1800型紫外分光光度計，日本島津；ZQLY-180型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器；4L發(fā)酵罐，上海保興生物設備工程有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；離心機。

1.2 培養(yǎng)基

斜面保藏培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，瓊脂20。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：蔗糖10，酵母浸粉3，蛋白胨5，麥芽浸粉3。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的制備

將近平滑假絲酵母ATCC 7330接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角搖瓶中， 28 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)14 h；然后接種于4 L發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)，20 h時下罐；5 000 r·min-1離心10 min，收集菌體，并用蒸餾水洗滌2次，于-80 ℃下冷凍保藏。

1.3.2 粗酶液的制備

采用超聲波破碎法對酵母菌進行破壁處理。按菌體∶緩沖液=1∶5的比例加入緩沖液，混合均勻；冰水浴中超聲破碎40 min(超聲2 s，停4 s)；4 ℃、11 000 r·min-1冷凍離心20 min，取上清液，即為羰基還原酶粗酶液。

1.3.3 雙水相體系的建立[10-11]

根據(jù)需求，按一定質量比加入無機鹽及PEG，混勻，確保雙水相體系達到穩(wěn)定。

1.3.4 最佳萃取工藝的確定

分別考察無機鹽種類、PEG分子量及質量分數(shù)、(NH4)2SO4質量分數(shù)、萃取溫度及萃取時間等對羰基還原酶萃取效果的影響，確定最佳萃取工藝。以羰基還原酶的純化倍數(shù)來表征萃取效果。

1.3.5 羰基還原酶的酶活測定及純化倍數(shù)的計算[12]

因為輔酶NADH在340 nm處有特征吸收峰而NAD+沒有，當輔酶NADH被氧化為NAD+后吸光度會下降，因此，可以通過測定反應過程中340 nm處吸光度的變化來衡量羰基還原酶的酶活。測定酶活的標準條件：總反應體積為1 000 μL，分別加入100 μL 0.2 mmol·L-1NADH、100 μL 4 mmol·L-1底物苯乙酮、700 μL 100 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)，30 ℃恒溫水浴2 min，加入適量酶液后用分光光度計測定340 nm處吸光度，按式(1)計算酶活(U·mL-1)：

(1)

式中：ΔA為1 min內340 nm處吸光度的變化；V總為反應液的體積，mL；6 220為NADH的摩爾消光系數(shù)，L·mol-1·cm-1；1為光程距離，cm；V為粗酶液的體積，mL。

酶活定義：在上述條件下，1 min消耗1 μmol NADH所需的酶量為1個酶活單位。

按式(2)計算羰基還原酶的純化倍數(shù)：

(2)

式中：E1為萃取后羰基還原酶酶活，U·mL-1；P1為萃取后羰基還原酶蛋白含量，mg·mL-1；E2為羰基還原酶粗酶酶活，U·mL-1；P2為羰基還原酶粗酶蛋白含量，mg·mL-1。

蛋白含量的測定：采用Bradford法。

2 結果與討論

2.1 無機鹽種類對羰基還原酶萃取效果的影響

雙水相體系中的無機鹽種類是雙水相能否形成的關鍵因素之一，也是所形成的雙水相是否適合酶的重要因素。通常，酶在PEG中是十分穩(wěn)定的。因此，將PEG1000分別與硫酸銨鹽[(NH4)2SO4]體系、磷酸鈉鹽體系組成雙水相體系，考察無機鹽種類對羰基還原酶純化倍數(shù)的影響，結果見表1。

表1無機鹽種類對羰基還原酶純化倍數(shù)的影響

Tab.1 Effect of types of inorganic salts on purificationmultiples of carbonyl reductase

無機鹽種類上相酶活U·mL-1上相蛋白含量mg·mL-1純化倍數(shù)硫酸銨鹽體系0.460.652.30磷酸鈉鹽體系0.180.511.13

由表1可知，硫酸銨鹽體系的純化倍數(shù)高于磷酸鈉鹽體系，說明硫酸銨鹽體系對蛋白的選擇性更高。由于磷酸鈉鹽質量分數(shù)的變化可能會影響酶活，而蛋白在硫酸銨鹽溶液中無論析出與否都十分穩(wěn)定[13]；此外，硫酸銨還具有溶解速度快、分相能力強、價格便宜等優(yōu)點。因此，綜合考慮，選用PEG/(NH4)2SO4雙水相體系。由于酶活力主要集中在上相，可見羰基還原酶主要分配在上相中，因此，雙水相萃取羰基還原酶時，主要對上相進行檢測。

2.2 PEG分子量對羰基還原酶萃取效果的影響

將質量分數(shù)為15%的(NH4)2SO4溶液分別與質量分數(shù)為15%的PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000配制成雙水相體系，待雙水相體系穩(wěn)定后加入粗酶液，混勻，靜置10 min，離心，取上相檢測酶活與蛋白含量，計算純化倍數(shù)，結果見圖1。

圖1 PEG分子量對純化倍數(shù)的影響Fig.1 Effect of PEG molecular weight on purification multiple

由圖1可知，隨著PEG分子量的增大，純化倍數(shù)先增大后減小，在PEG分子量為1 000時達到最大。因此，選擇PEG1000作為成相組分。

2.3 PEG1000質量分數(shù)對羰基還原酶萃取效果的影響

將質量分數(shù)為15%的(NH4)2SO4溶液分別與質量分數(shù)為12%、15%、18%、21%、24%、27%的PEG1000溶液配制成雙水相體系，待雙水相體系穩(wěn)定后加入粗酶液，混勻，靜置10 min，離心，取上相檢測酶活與蛋白含量，計算純化倍數(shù)，結果見圖2。

圖2 PEG1000質量分數(shù)對純化倍數(shù)的影響Fig.2 Effect of PEG1000 mass fraction on purification multiple

由圖2可知，在PEG1000質量分數(shù)為12%～18%時，純化倍數(shù)隨PEG1000質量分數(shù)的增加而增大，當PEG1000質量分數(shù)為18%時，純化倍數(shù)達到最大；之后，純化倍數(shù)迅速減小。因此，選擇PEG1000質量分數(shù)為15%～21%。

2.4 (NH4)2SO4質量分數(shù)對羰基還原酶萃取效果的影響

將質量分數(shù)為15%的PEG1000溶液分別與質量分數(shù)為14%、16%、18%、20%、22%、24%的(NH4)2SO4溶液配制成雙水相體系，待雙水相體系穩(wěn)定后加入粗酶液，混勻，靜置10 min，離心，取上相檢測酶活與蛋白含量，計算純化倍數(shù)，結果見圖3。

圖3 (NH4)2SO4質量分數(shù)對純化倍數(shù)的影響Fig.3 Effect of (NH4)2SO4 mass fraction on purification multiple

由圖3可知，隨著(NH4)2SO4質量分數(shù)的增加，純化倍數(shù)先增大后減小，在(NH4)2SO4質量分數(shù)為16%時達到最大，且這個過程與(NH4)2SO4沉淀蛋白的規(guī)律相似?？梢酝茰y，在到達最適(NH4)2SO4質量分數(shù)前，(NH4)2SO4先沉淀了一些雜蛋白，從而使純化倍數(shù)增大;但當(NH4)2SO4質量分數(shù)過高時，會使目的蛋白也沉淀下來，導致最后純化倍數(shù)變小。實驗過程中有一些白色的蛋白沉淀夾在兩相中也佐證了這一點。因此，選擇(NH4)2SO4質量分數(shù)為14%～18%。

2.5 萃取溫度對羰基還原酶萃取效果的影響

將質量分數(shù)均為15%的(NH4)2SO4溶液、PEG1000溶液配制成雙水相體系，待雙水相體系穩(wěn)定后加入粗酶液，混勻，分別在4 ℃、12 ℃、20 ℃、28 ℃、36 ℃、44 ℃下靜置10 min，離心，取上相檢測酶活與蛋白含量，計算純化倍數(shù)，結果見圖4。

圖4 萃取溫度對純化倍數(shù)的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on purification multiple

由圖4可知，隨著萃取溫度的升高，純化倍數(shù)先增大后減小，在4～20 ℃范圍內萃取溫度對純化倍數(shù)的影響較小。可見，在一定范圍內，萃取溫度升高可以促進雙水相萃取酶的進程；但是過高的萃取溫度會影響酶活性，導致酶失活，使純化倍數(shù)減小。因此，選擇萃取溫度為4～20 ℃。

2.6 萃取時間對羰基還原酶萃取效果的影響

將質量分數(shù)均為15%的(NH4)2SO4溶液、PEG1000溶液配制成雙水相體系，待雙水相體系穩(wěn)定后加入粗酶液，混勻，分別靜置10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，離心，取上相檢測酶活與蛋白含量，計算純化倍數(shù)，結果見圖5。

圖5 萃取時間對純化倍數(shù)的影響Fig.5 Effect of extraction time on purification multiples

由圖5可知，在20 min內純化倍數(shù)差異較?。浑m然延長萃取時間有利于酶在雙水相中的分配，但純化倍數(shù)迅速減小并穩(wěn)定在一定范圍內。因此，萃取時間控制在20 min內為宜。

2.7 萃取工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結果，選取(NH4)2SO4質量分數(shù)(A)、PEG1000質量分數(shù)(B)、萃取溫度(C)、萃取時間(D)為考察因素，進行4因素3水平的L9(34)正交實驗優(yōu)化萃取工藝。正交實驗的結果與分析見表2。

由表2可知，各因素對萃取效果的影響大小依次為:(NH4)2SO4質量分數(shù)>PEG1000質量分數(shù)>萃取溫度>萃取時間。進行方差分析F檢驗，C、D兩個因素的F值分別為3.174和1.000，小于F臨界值19，表明C、D兩個因素對純化倍數(shù)的影響不顯著；而A、B兩個因素的F值分別為22.391和22.370，遠大于F臨界值19，表明A、B兩個因素對純化倍數(shù)的影響顯著。通過正交實驗k值分析，確定最優(yōu)組合為A1B3C3D1，即(NH4)2SO4質量分數(shù)15%、PEG1000質量分數(shù)19%、萃取溫度16 ℃、萃取時間15 min。對此條件進行驗證實驗，羰基還原酶的純化倍數(shù)達到6倍，與7號實驗接近，可見在較窄時間范圍內萃取時間對純化倍數(shù)影響很小。

表2正交實驗的結果與分析

Tab.2Results and analysis of orthogonal experiments

實驗號A.(NH4)2SO4質量分數(shù)/%B.PEG1000質量分數(shù)/%C.萃取溫度℃D.萃取時間min純化倍數(shù)11(15)1(17)1(8)1(15)5.05122(16)1(17)2(12)2(20)4.51933(17)1(17)3(16)3(25)4.54241(15)2(18)2(12)3(25)5.79152(16)2(18)3(16)1(15)5.37263(17)2(18)1(8)2(20)4.64571(15)3(19)3(16)2(20)6.00682(16)3(19)1(8)3(25)5.29293(17)3(19)2(12)1(15)5.234k15.6164.7044.9965.219k25.0615.2705.1815.057k34.8075.5115.3075.208R0.8090.8070.3110.162F22.39122.3703.1741.000

3 結論

通過單因素實驗和正交實驗研究了聚乙二醇(PEG)/硫酸銨[(NH4)2SO4]雙水相體系萃取近平滑假絲酵母ATCC 7330粗酶液中羰基還原酶的工藝，考察了無機鹽種類、PEG分子量及其質量分數(shù)、(NH4)2SO4質量分數(shù)、萃取溫度、萃取時間等因素對羰基還原酶純化倍數(shù)的影響。結果表明，(NH4)2SO4質量分數(shù)、PEG1000質量分數(shù)為顯著性影響因素，確定最優(yōu)的雙水相萃取條件為：(NH4)2SO4質量分數(shù)15%、PEG1000質量分數(shù)19%、萃取溫度16 ℃、萃取時間15 min，在此條件下，羰基還原酶的純化倍數(shù)可達6倍。本研究為近平滑假絲酵母ATCC 7330中羰基還原酶在手性化合物的綠色合成中的應用奠定基礎。