邢漢君，吳民熙,，郭照輝,，方雅瑜，羅容珺,，伍善東,，單世平,，冉啟洋

(1.湖南恒凱環(huán)保科技投資有限公司，湖南 長沙 410000；2.湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410000；3.持久性有機污染微生物生態(tài)修復湖南省工程實驗室，湖南 長沙 4100004.湖南省有機污染場地修復工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410000)

隨著全球工業(yè)化的迅速發(fā)展，石油和石油產(chǎn)品已經(jīng)成為工業(yè)生產(chǎn)和日常生活中的主要能源來源，石油使用量急劇增加，每年產(chǎn)量約為4×109t[1]。但在石油的開采、運輸、加工和使用過程中，部分石油進入周邊土壤甚至地下水，造成石油污染，嚴重危害人類健康，其生態(tài)風險難以預估[2]。探索有效的石油污染修復治理技術(shù)已成為國內(nèi)外研究者的關(guān)注重點。

石油污染物主要成分為石油烴，包含鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴，其中又以烷烴居多，約占石油烴總含量的50%以上[3]。短鏈烷烴(如甲烷)一般以氣體形態(tài)存在，易揮發(fā)，正十六烷等中長鏈烷烴較難在環(huán)境中降解，易污染周邊環(huán)境，是較常見的石油污染源。目前，石油污染物的修復方法主要包括物理法、化學法和生物法。相較于物理法和化學法，生物法具有成本較低、對原環(huán)境擾動較小、無二次污染等特點[4-6]。研究[7-9]表明，在適宜條件下大多數(shù)石油烴均能被微生物代謝、降解。因此，篩選出能夠高效降解石油烴的微生物，成為微生物治理石油污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

作者通過富集培養(yǎng)，從長沙某地長期受石油污染的土壤中馴化篩選出一株能利用正十六烷作為碳源和能源的菌株，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹分析等對其進行鑒定，通過單因素實驗研究了不同培養(yǎng)條件(初始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量和正十六烷初始濃度)對菌株 YJ1生長的影響及其對正十六烷的降解性能。旨在為石油污染場地微生物治理技術(shù)提供理論指導與技術(shù)支撐。

1 實驗

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

土壤樣品：采集長沙某動力配件廠油庫及其周邊長期受油料污染的表層(0～12 cm)土壤，放入無菌自封袋中，冰袋保溫，送回實驗室后立即置于4 ℃冰箱保存。

聚合酶鏈反應(PCR)擴增試劑，TAKARA公司；柱式細菌DNA提取試劑盒，上海生工生物有限公司；通用引物，上?？道噬锟萍加邢薰荆皇兔?、正十六烷等試劑，國藥集團化學試劑有限公司。

無機鹽培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 1.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NH4NO31.0 g，CaCl20.02 g，F(xiàn)e2(SO4)30.02 g，正十六烷 10 mL，蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

正十六烷無機鹽培養(yǎng)基：1 L無機鹽培養(yǎng)基加入正十六烷10 mL。

牛肉膏蛋白胨(BP)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 菌株的富集、純化與篩選

將采集的10 g土壤樣品加到含適量正十六烷無機鹽培養(yǎng)基錐形瓶中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，于30 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)5 d；吸取5 mL富集液置于95 mL新鮮的正十六烷無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在相應瓊脂培養(yǎng)基上進行分離和純化，重復上述步驟。將純化得到的單菌落轉(zhuǎn)接入相應的無機鹽斜面上，于4 ℃冰箱中保存。

1.3 菌株的鑒定

菌株形態(tài)特征以及生理生化特征鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]?；蛐蛄蟹治霾捎?6S rDNA進行[11]，送至上海生工生物技術(shù)有限公司進行測序。將測序結(jié)果在Genbank進行對比分析后，通過ClustalX 2.0和MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌株的生長特性

1.4.1 生長曲線的繪制

將篩選出的菌株用0.85%生理鹽水進行稀釋，直至菌懸液OD600值為 0.1時，吸取1 mL菌懸液接入99 mL BP培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取一次樣，用分光光度計測定OD600值，做3個重復。以OD600值表示該菌株的生物量。

1.4.2 不同培養(yǎng)條件對菌株生長的影響

以正十六烷作為唯一碳源，分別考察初始pH值(5、6、7、8、9)、培養(yǎng)溫度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)、接種量(2%、4%、6%、8%、10%)和正十六烷初始濃度(2 mL·L-1、5 mL·L-1、10 mL·L-1、15 mL·L-1、20 mL·L-1)對篩選菌株生長的影響。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的篩選菌株接種至含正十六烷的100 mL無機鹽培養(yǎng)基中，分別在不同培養(yǎng)條件下180 r·min-1振蕩培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)期間每天觀察菌株生長情況，每隔2 d用分光光度計測定OD600值，每組設3個平行。

1.5 菌株對正十六烷的降解率測定

菌株降解正十六烷實驗：將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌株按10%的接種量接入以10 mL·L-1正十六烷為碳源的無機鹽培養(yǎng)基(pH=7)中，于30 ℃、180 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)；以不加菌株為對照，分別恒溫振蕩培養(yǎng)5 d、10 d、15 d。整瓶提取培養(yǎng)液，用石油醚萃取后，測定對應波長下的吸光度，計算降解率，取樣分析正十六烷殘留量，每組設3個平行。

正十六烷標準曲線：將待測溶液經(jīng)萃取后定容，測定吸光度并繪制標準曲線，得正十六烷標準曲線方程為：y=0.1969x-0.2173，R2=0.9976。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的形態(tài)、生理生化特征及分子生物學鑒定

通過篩選從土壤樣品中分離得到一株能以正十六烷為唯一碳源生長的菌株，命名為YJ1，菌株形態(tài)見圖1。

圖 1 菌株YJ1在BP平板(a)和光學顯微鏡下(b)的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain YJ1 on BP plate(a) and under optical microscope(b)

菌株YJ1在BP培養(yǎng)基中菌落呈淡黃色，凸起，邊緣齊整，表面濕潤，不易挑起(圖1a)；菌株YJ1在光學顯微鏡下呈直桿狀，革蘭氏染色呈陽性(圖1b)。

菌株YJ1的生理生化特征見表1，化學敏感試驗結(jié)果見表2。

表 1菌株YJ1的生理生化特征

Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain YJ1

注：“+”為陽性反應，“-”為陰性反應。

表2菌株YJ1的化學敏感試驗結(jié)果

Tab.2 Results of chemical sensitivity of strain YJ1

注：“-”為不敏感，“+”為敏感。

將測得的菌株YJ1的16S rDNA序列在NCBI上進行比對和同源性分析，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)分析比對發(fā)現(xiàn)，其與短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)多個菌株序列的同源性較高，序列相似度達到79%。

圖 2 基于16S rDNA序列構(gòu)建菌株YJ1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain YJ1 based on 16S rDNA gene sequences

通過對菌株YJ1的形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析，初步確定菌株YJ1屬于細菌，在生物學上的分類屬于短芽孢桿菌屬。

2.2 菌株的生長曲線(圖3)

從圖3可以看出，0～10 h為菌株YJ1的生長延遲期，10～32 h為菌株YJ1的生長對數(shù)期，32～42 h為菌株YJ1的生長穩(wěn)定期。當菌株進入生長對數(shù)期至穩(wěn)定期時，測得的吸光度較高，表明此時菌株YJ1的生長繁殖能力較強，培養(yǎng)基中細菌總量較多。從44 h開始菌株YJ1進入衰亡期，由于前一階段細菌的大量繁殖，使得此時培養(yǎng)基中的以正十六烷為主的營養(yǎng)物質(zhì)基本被消耗完，培養(yǎng)基內(nèi)細菌的平均死亡速率遠快于其生長速率，造成細菌總量減少。

圖3 菌株YJ1的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain YJ1

2.3 不同培養(yǎng)條件對菌株YJ1生長的影響(圖4)

pH值對細菌生長的影響主要表現(xiàn)在：一方面影響細胞質(zhì)膜的透性和穩(wěn)定性；另一方面通過對營養(yǎng)物質(zhì)的溶解性或電離性影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響微生物的生長速率[14]。從圖4a可以看出，菌株YJ1對初始pH值的適應范圍較小，僅在初始pH值為6～8之間生長較好，在堿性條件(pH=9)下的生物量要大于酸性條件(pH=5)。菌株YJ1生長的最適初始pH值為7。

從圖4b可以看出，培養(yǎng)溫度過高或過低對菌株YJ1的生長影響較大，40 ℃時，菌株YJ1幾乎停止生長；20 ℃時，菌株YJ1也生長緩慢。但培養(yǎng)溫度為30 ℃、35 ℃時，菌株生物量明顯高于其它溫度條件下的，其中培養(yǎng)溫度為30 ℃時菌株YJ1生長最佳。

圖4 不同培養(yǎng)條件對菌株YJ1生長的影響Fig.4 Effect of different culture conditions on growth of strain YJ1

從圖4c可以看出，菌株YJ1在不同接種量的培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 d后都迅速生長，接種量大小與菌株生長呈正比關(guān)系，即接種量越大，菌株的生物量越多，即菌株適應環(huán)境的能力越強。其中接種量為10%的菌株YJ1生物量是接種量為2%的生物量的3倍左右，而菌株YJ1在接種量為2%的培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 d后才逐步適應環(huán)境，生物量有所增加，6 d后生物量逐步下降。菌株YJ1生長的最適接種量為10%。

從圖4d可以看出，在各正十六烷初始濃度條件下，培養(yǎng)0～6 d,菌株YJ1生物量快速增加。正十六烷作為菌株唯一的碳源，濃度越高可被菌株利用的物質(zhì)就越多，所篩選菌株YJ1能很好地利用正十六烷。但培養(yǎng)10 d時，20 mL·L-1濃度的菌株生物量較其它濃度(除2 mL·L-1濃度外)的生物量低，可能是底物充足條件下，菌株大量代謝作用產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物對菌株產(chǎn)生一定的毒害，導致菌株活力減弱，生物量下降。菌株YJ1生長的最適正十六烷初始濃度為10 mL·L-1。

2.4 降解實驗結(jié)果

菌株YJ1培養(yǎng)不同時間后對正十六烷的降解率見圖5。

圖5 菌株YJ1培養(yǎng)不同時間后對正十六烷的降解率Fig.5 Degradation rate of n-hexadecane by strain YJ1 cultured for different time

菌株YJ1以正十六烷為唯一碳源進行代謝活動，不斷消耗培養(yǎng)基內(nèi)的碳源。從圖5可以看出，菌株YJ1在正十六烷初始濃度為10 mL·L-1的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)5 d、10 d、15 d時，對正十六烷的降解率分別為11.5%、63.5%、66.7%，可見隨著細菌生物量增加，溶液中碳源減少，有毒副產(chǎn)物增加，導致降解率上升緩慢。同時說明所篩選菌株YJ1對正十六烷具備較強的降解能力。

3 結(jié)論

從長沙某長期受油料污染土壤中馴化篩選得到一株正十六烷降解菌YJ1，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹分析等對其進行鑒定，初步確定菌株 YJ1屬于短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)。通過單因素實驗確定菌株YJ1的最適培養(yǎng)條件為：初始pH值7、培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量10%、正十六烷初始濃度10 mL·L-1。在最適條件下培養(yǎng)15 d，菌株YJ1對正十六烷的降解率可達66.7%，降解效果良好。綜合菌株的生長條件和降解能力，初步認為菌株YJ1較適用于類似石油污染中正十六烷污染修復。