黃怡晴，邢 云，劉順治，范世明，蔡邦平，丘鷹昆*

(1.廈門大學(xué)，福建 廈門 361105；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122；3.廈門園林植物園，福建 廈門 361003)

黃果野鴉椿(Euscaphis japonicavar.wupingensis)是省沽油科野鴉椿屬植物[1]，其原種野鴉椿(E.japonica)在福建已廣泛種植，資源十分豐富，野鴉椿的果具有消腫止痛、溫中理氣的功效[2—3]。

其與原種野鴉椿的主要區(qū)別是果皮顏色不同，黃果野鴉椿的果皮為黃色，原種野鴉椿的果皮為紅色[4]。不同品種植物代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分差異，對(duì)植物分類與鑒別具有一定的輔助與驗(yàn)證意義。

二維色譜是通過(guò)一定的接口技術(shù)，將有兩種不同分離機(jī)制的色譜柱進(jìn)行串聯(lián)，樣品在經(jīng)過(guò)第一維色譜柱分離之后，在接口處，經(jīng)過(guò)濃縮、富集、切割等方式，進(jìn)入第二維色譜柱，進(jìn)行二次分離，在線二維色譜比一維色譜更為有效[5—6]。本文采用二維液相色譜分析黃果野鴉椿及其原變種的代謝產(chǎn)物差異，為二者的化學(xué)鑒別提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野鴉椿和黃果野鴉椿成熟的果皮，采自廈門園林植物園。樣品標(biāo)本貯藏于廈門園林植物園標(biāo)本室，標(biāo)本號(hào)3621 和4031。

二維液相色譜基于安捷倫1100 型液相色譜儀構(gòu)建(Agilent 1100，Agilent Technologies Inc.,Santa Clara 美國(guó))；甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，F(xiàn)airfleld，CT，美國(guó))，Kinetex XB-C18 色譜柱(50 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm，Phenomenex，美國(guó))，Cosmosil C18-PAQ色譜柱(250 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm，Nakalai Tesque，日本)，Cosmosil C18-PAQ 富集柱(10 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm，Nakalai Tesque，日本)。

1.2 供試液制備

稱取干燥藥材100 mg，置于2 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，超聲提取30 min。使用0.22 μm 微孔膜過(guò)濾，濾液保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 一維色譜分析條件

野鴉椿、黃果野鴉椿果皮的供試品溶液，分別用Cosmosil C18-PAQ 色譜柱(250 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)進(jìn)行一維色譜分析，以比較其代謝產(chǎn)物差異。HPLC 分析條件如下：進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相甲醇(B)/水(A)；洗脫程序：0→30 min，0% B→100% B；流速1.0 mL·min-1；柱溫常溫；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.4 RPLC×RPLC 二維液相色譜分析條件

1.4.1 第1 維色譜參數(shù)

色譜柱：Kinetex biphenyl 聯(lián)苯基柱(250 mm ×4.6 mm i.d.，5 μm)；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)相甲醇(B)/水(A)。洗脫程序：0→300 min→320 min，5%B→100% B→100% B；流速0.1 mL·min-1；室溫；波長(zhǎng)254 nm。

1.4.2 稀釋–吸附接口參數(shù)

稀釋液：0.1%甲酸/水；吸附柱：Cosmosil C18-PAQ 富集柱(10 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)；稀釋倍數(shù)3 倍；閥切換時(shí)間5 min。

1.4.3 第2 維色譜參數(shù)

色譜柱：Kinetex XB-C18 柱(50 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(B)/水(A)；洗脫程序：0→4.0 min→4.1 min→5.0 min，0% B→45% B→0% B→0% B；流速3 mL·min-1；室溫；波長(zhǎng)254 nm。

1.5 RPLC-RPLC 中心切割二維色譜分析條件

1.5.1 第1 維色譜參數(shù)

色譜柱：Kinetex biphenyl 聯(lián)苯基柱(250 mm ×4.6 mm i.d.，5 μm)；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相甲醇(B)/水(A)；洗脫程序：0→30 min，5% B→100% B；流速1 mL·min-1；溫度室溫；波長(zhǎng)254 nm。

1.5.2 中心切割參數(shù)

切割時(shí)段：14～17 min；稀釋液0.1%甲酸/水；吸附柱Cosmosil C18-PAQ 富集柱(10 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)；稀釋倍數(shù)3 倍。

1.5.3 第2 維色譜參數(shù)

Cosmosil C18 色譜柱(250 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)；流動(dòng)相乙腈(B)/水(A)；洗脫程序：0～30 min，0%～45%B；流速1 mL·min-1；室溫；波長(zhǎng)254 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 一維液相色譜(C18 色譜柱)分析

如圖1 所示，黃果野鴉椿、野鴉椿果皮1D-HPLC的分析可以看出，二者的代謝產(chǎn)物極其相似，僅僅依靠一維液相色譜難以區(qū)分二者的差異。

2.2 二維色譜系統(tǒng)分析條件的優(yōu)化

單純使用一維色譜分析難以區(qū)分黃果野鴉椿、野鴉椿的差異，進(jìn)一步采用RPLC×RPLC 二維液相色譜體系進(jìn)行分析，在二維色譜中組合不同分離機(jī)制的反相色譜柱，以獲得更加理想的分離效果。

考察不同型號(hào)色譜柱，從中選擇分離效果好，與第2 維C18 色譜柱具有分離差異的作為第1 維的色譜柱。結(jié)果表明，Kinetex biphenyl 聯(lián)苯基柱的分離效果最好，色譜峰的數(shù)量最多，故選擇Kinetex biphenyl 聯(lián)苯基柱作為二維色譜的第1 維色譜柱。

Phenomenex 公司的Kinetex 系列核殼色譜柱，具有背壓低、理論塔板數(shù)高的優(yōu)點(diǎn)，基于樣品特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選擇Kinetex XB-C18 色譜柱(50 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm)作為第2 維色譜柱。由于第2 維色譜柱采用較高的分析流速(3 mL·min-1)，因此流動(dòng)相選擇壓力更低的乙腈/水體系。

2.3 黃果野鴉椿及其原變種的RPLC×RPLC 二維色譜分析

運(yùn)用上述優(yōu)化的色譜條件對(duì)黃果野鴉椿及其原變種供試液樣品進(jìn)行RPLC×RPLC 二維色譜分析。樣品經(jīng)第1 維色譜分離，每5 min 切割成一段，在稀釋–吸附接口的參與下，送入第2 維進(jìn)一步分離，黃果野鴉椿及其原變種的RPLC×RPLC 二維色譜分析如圖2 所示。兩者的RPLC×RPLC 二維色譜分析圖譜較為相似，絕大多數(shù)成分僅有含量上的差異。但在第1 維萘基柱分析時(shí)間的約150 min 處，其組分進(jìn)入第2 維分離時(shí)顯示，含有較為明顯的差異性成分(圖2)。

圖1 黃果野鴉椿和野鴉椿果皮甲醇提取液一維液相圖Fig.1 1D-HPLC analysis of the peer of Euscaphis japonica var. wupingensis and E.japonica

圖2 黃果野鴉椿及其原變種的RPLC×RPLC 二維色譜分析圖譜Fig.2 The 2D RPLC×RPLC separation of the peer of Euscaphis japonica var.wupingensis and E.japonica

2.4 黃果野鴉椿及其原變種的RPLC-RPLC 中心切割二維色譜分析

鑒于差異性的成分在萘基柱上較為集中(總分析時(shí)間約50%前后)，因此可以采用中心切割方式，先用萘基柱對(duì)差異成分進(jìn)行富集，再進(jìn)行C18 柱分離。從圖3 可見(jiàn)，黃果野鴉椿及其原變種有3 個(gè)較為顯著的差異成分。黃果野鴉椿供試液在23.39 min出峰，而野鴉椿并未檢出該色譜峰；野鴉椿的供試液在20.56 min、24.96 min 有其特征峰，而黃果野鴉椿中則未檢出。

圖3 黃果野鴉椿及其原變種的RPLC-RPLC 中心切割二維色譜圖普Fig.3 Heart-cutting RPLC-RPLC analysis of the peer of Euscaphis japonica var.wupingensis and E.japonica

3 討論

野鴉椿屬的分類一直存在爭(zhēng)議[7—8]，近年來(lái)，不少學(xué)者嘗試將分子生物學(xué)等技術(shù)手段與形態(tài)識(shí)別相結(jié)合，以突破傳統(tǒng)鑒定方法的局限[9—10]。

采用在線二維色譜手段能夠?qū)ⅫS果野鴉椿及其變種甲醇提取物之間細(xì)微的化學(xué)差異鑒別出來(lái)。根據(jù)黃果野鴉椿果皮甲醇提取液和野鴉椿果皮甲醇提取液的化學(xué)成分檢測(cè)，黃果野鴉椿及其原變種有3個(gè)較為顯著的差異成分，為黃果野鴉椿作為野鴉椿的變種的鑒別提供化學(xué)輔助手段。

由于兩者之間的差異較小且在線二維色譜分析上樣量有限，未能直接通過(guò)在線二維色譜分析手段將其成分鑒定出來(lái)，后續(xù)需要其他分析手段進(jìn)一步分析。