鴨甲型肝炎病毒的遺傳演化分析

馬秀麗　馮永勝　郝小靜　周圍　衣服德　代永聯(lián)　宋玲玲　謝元超　宋敏訓　艾武

摘? 要：本研究測定了實驗室2018～2019年分離的11株鴨甲型肝炎病毒1型（DHAV-1）和37株鴨甲型肝炎病毒3型（DHAV-3）的VP1基因序列，并選取代表毒株與已知陽性血清進行中和試驗，分別分析DHAV-1或DHAV-3的遺傳和抗原穩(wěn)定性。結(jié)果表明，DHAV-1進化為兩個遺傳分支，2018～2019年的分離毒株分布在1b分支上，而經(jīng)典DHAV-1毒株處于不同的1a分支上。DHAV-3進化為兩個不同的分支，2018～2019年分離毒株大部分集中在3a分支上，個別毒株分布在3b分支上。DHAV-1或DHAV-3毒株之間均無明顯的地理分布差異。血清交叉中和試驗結(jié)果表明，DHAV-1或DHAV-3同一血清型之間仍具有較好的交叉保護，表明同一血清型的DHAV尚未發(fā)生抗原變異。

關(guān)鍵詞：鴨甲型肝炎病毒;遺傳演化

中圖分類號：S858.325.3? ? ?文獻標識碼：B? ? ?文章編號：1673-1085（2020）2-0010-07

鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）主要危害3周齡以下的雛鴨，死亡率高達90%以上，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大危害[1]。DHAV分為DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3[2]。DHAV-1的危害普遍存在，DHAV-2僅見我國臺灣報道[3]。近年來，DHAV-3的流行仍占主導地位，個別鴨場還見有DHAV-1和DHAV-3混合感染的現(xiàn)象[4]。三者之間存在顯著的序列差異，遺傳進化關(guān)系表明三者屬于三個不同的基因型，血清學試驗證明三者之間無交叉反應(yīng)[5-6]。隨著DHAV-1和DHAV-3的危害日趨嚴重[7-9]，該病的遺傳演化備受關(guān)注。為進一步分析當前DHAV的流行特點和變異現(xiàn)狀，本研究對本實驗室2018-2019年保存的11株DHAV-1和37株DHAV-3以及Genbank中下載的DHAV代表株的VP1基因進行了生物信息學分析，結(jié)合代表毒株的生物學特性，揭示了近兩年DHAV-1和DHAV-3的遺傳演化情況，對鴨甲型肝炎病毒的綜合防控具有重要的指導意義。

1? 材料與方法

1.1? DHAV毒株和陽性血清? 本實驗室分離保存的11株DHAV-1，見表1;37株DHAV-3，見表2。1-CL/03和3-FX/08單因子陽性血清由本實驗室制備并保存。

1.2? DHAV VP1基因的擴增? 參考Genbank中已發(fā)表的DHAV-1和DHAV-3 VP1基因組序列，分別設(shè)計一對特異性引物。

DHAV-1：Sense primer：

5' CTCGAGGGTGATTCTAACCAGTT 3'，

DHAV-1：Anti-sense primer：

5' GCGGCCGCTTCAATTTCCAGATT 3';

DHAV-3：Sense primer：

5' CTCGAGGGTGATTCCAATCAGCT 3'，

DHAV-3：Anti-sense primer：

5' GCGGCCGCTTCAATYTCCARAT 3'。

Trizol方法提取病毒RNA，按常規(guī)RT-PCR方法擴增收集DHAV毒株的VP1基因，回收的PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體中，雙酶切法鑒定陽性重組子，由北京博尚生物有限公司完成測序。

1.3? DHAV VP1蛋白的遺傳進化分析? 采用MEGA6.0軟件對測定的DHAV毒株與Genbank中下載的參考序列（表3）的VP1基因的核苷酸和氨基酸序列進行比較，用Boot-strap法（Replication值為1000）計算遺傳距離并繪制N-J進化樹，分析當前國內(nèi)DHAV的流行情況及不同毒株氨基酸的變異程度。

1.4? 血清交叉中和試驗? 采用固定病毒稀釋血清方法進行交叉中和試驗。將自制的1-CL/03單因子血清作2倍倍比稀釋，分別與等體積的病毒含量為200ELD50/0.1mL的DHAV-1代表毒株1-WF/18和1-LY1/19混合;將自制的3-FX/08單因子血清作2倍倍比稀釋，分別與等體積的病毒含量為200ELD50/0.1mL的DHAV-3代表毒株3-JN1/18和3-TA1/19混合，充分作用后分別接種非免鴨胚，37℃溫箱培養(yǎng)，記錄結(jié)果，用Reed和Muench兩氏法計算血清中和指數(shù)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? DHAV VP1基因的序列分析? 序列分析發(fā)現(xiàn)，近兩年分離的DHAV-1毒株之間VP1基因的核苷酸序列相似性為97.7%～99.9%，與早些年分離毒株1-CL/03之間序列相似性僅為93.8%～94.4%。近兩年DHAV-3毒株之間VP1基因的核苷酸序列相似性為96.4%～99.7%，與早些年分離毒株3-FX/08之間序列相似性為94.3%～95.6%。DHAV-1和DHAV-3毒株之間VP1存在一些氨基酸變異位點，主要集中在143～147位、171～201位、204～212和217～224位。由于這些氨基酸變異位點的存在導致了DHAV-1和DHAV-3之間抗原性的差異，因此表現(xiàn)出DHAV-1與DHAV-3的交叉反應(yīng)性很低或無交叉中和反應(yīng)[3，6]。2018～2019年DHAV-1分離毒與1-CL/03比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在5處氨基酸位點的改變（43位，180位、184位和213位）。2018～2019年DHAV-3分離毒株與3-FX/08代表株比較，主要存在6處氨基酸位點的改變（49位、141位、185位、188位、207位和210位），結(jié)合血清中和試驗結(jié)果，表明這些氨基酸位點的改變并沒有影響DHAV-1或DHAV-3之間的中和特性。

2.2? 遺傳進化分析? 根據(jù)繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，DHAV-1進化為兩個分支1a和1b（圖1），1a分支為2013年以前的分離毒株，1b分支為近幾年的分離毒，2018～2019年分離毒都分布在該分支上，其中2013年的分離毒1-HA5/13也分布在這個分支上。DHAV-3也進化為2個大分支3a和3b（圖2），3b分支為經(jīng)典的毒株3-AP04114/03，3-B63/08和3-NC/09，僅有一株3-JN1/18分離株分布在該分支上;2018～2019年其余36株分離毒株均分布在該分支上。

2.3? DHAV血清交叉中和試驗? 分別選用DHAV-1代表毒株1-WF/18和1-LY1/19與已知1-CL/03血清進行中和試驗，中和指數(shù)均分別為209和256。DHAV-3代表毒株3-GT2/18和3-TA1/19與已知3-FX/08血清進行中和試驗，中和指數(shù)分別為170和174。結(jié)果表明不同分支的毒株之間仍有較好的交叉反應(yīng)。

3? 討論

3.1? DHAV遺傳進化分析? 本文根據(jù)DHAV-1和DHAV-3 VP1基因的遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，2018年至2019年的DHAV-1毒株全部集中分布在1b分支，處于1a分支的毒株均為2013年的部分毒株及2013年以前的毒株。結(jié)果表明，自2013年DHAV-1開始出現(xiàn)不同程度的變異。過去2年內(nèi)DHAV-3的進化未發(fā)生大的變化，2018年至2019年的DHAV-1毒株大部分集中分布在3a分支上，另一分支3b中只有早期分離的3個毒株，韓國的3-AP04114/03、越南的3-NC/09和北京的3-B63/08。3a分支的毒株又進一步分化成更小的亞分支，但這些毒株之間無明顯的時間和地理分布差異。

3.2? DHAV-1和DHAV-3的血清學特征? 我們選取近兩年分離的DHAV-1和DHAV-3代表毒株分別與已知的陽性血清1-CL/03和3-FX/08進行血清交叉中和試驗，其主要目的就是分析DHAV遺傳多樣性對抗原性的影響。結(jié)果表明，2018～2019年分離的DHAV-1和DHAV-3的抗原性相對穩(wěn)定，相同血清型之間仍有很好的交叉保護。

綜上所述，2018～2019年間DHAV的遺傳性和抗原性相對穩(wěn)定。目前來看DHAV-3的高進化速率并未造成該血清型病毒抗原性的改變[10-11]。盡管如此，我們還應(yīng)一如既往地做好DHAV的流行病學監(jiān)測，防止?jié)撛诘倪z傳變異引發(fā)該病的暴發(fā)和流行。

參考文獻：

[1]? Woolcock， P R. Diseases of Poultry，11th ed.[M] Iowa State Press， Ames， IA， 2003， pp：343-354.

[2]? Fu Yu，Pan Meng，Wang Xiaoyan，et al.Molecular detection and typing of duck hepatitis A virus directly from clinical specimens [J].Vet Microbiol， 2008， 131： 247-257.

[3]? Tseng C H， Tsai H J. Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus[J].Virus Res， 2007，126（2）： 19-31.

[4]? 孫曉軍，任建亭，劉金鳳，等.一起鴨甲肝病毒1型和3型混合感染的研究報道[J].家禽科學，2014（7）：15-18.

[5]? Kim MC， Kwon Y K， Joh S J， et al. Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 reveals a nove lineage close to the genus Parechovirus in the family Picornaviridae[J]. J Gen Virol， 2006， 87（Pt11）： 3307-3316.

[6]? Kim M C， Kwon Y K， Joh S J， et al. Recent Koren isolates of duck hepatitis virus revealed the presence of a new geno- and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 type strain[J ]. Arch Virol， 2007， 152： 2059-2072.

[7]? Ding C Y，Zhang D B. Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1[J]. Virology， 2007， 361（1）： 9-17.

[8]? Tseng C H， Knowle N J， Tsai H J. Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 indicates that it should be assigned to a new genus[J]. Virus Res， 2007，123（2）： 190-203.

[9]? Liu G Q，Wang F，Ni Z，et al.Complete genomic sequence of a Chinese isolate of duck hepatitis virus[J]. Virol Sinica， 2007， 22 （5）： 353-359.

[10]? Xiuli Ma，Zizhang Sheng，Bing Huang，et al. Molecular Evolution and Genetic Analysis of the Major Capsid Protein VP1 of Duck Hepatitis A Viruses Implications for Antigenic Stability[J]. PLOS ONE. DOI：10.1371/journal.pone.0132982， July 14， 2015.

[11]? 馬秀麗，黃兵，李玉峰，等.鴨甲型肝炎病毒的遺傳和抗原穩(wěn)定性分析[J].中國動物傳染病學報，2018，26（6）： 48-52.

Genetic evolution analysis of duck hepatitis a viruses

MA Xiuli1， FENG Yongsheng2，HAO Xiaojing2， ZHOU Wei2， YI Fude2， DAI Yonglian2，

SONG Lingling1， XIE Yuanchao3，SONG Minxun1， Ai Wu1

（1.Shandong Institute of Poultry Science， Shandong Academy of Agricultural Science， The Key lab of poultry disease diagnosis and immunology of Shandong Province， Poultry Breeding Engineering Technology Center of Shandong Province， Jinan 250023，China;

2.Qingdao Institute of animal husbandry and veterinary medicine，Qingdao 266000，China;

3.Shanghai Institute of Materia Medica，Shanghai 201203，China）

Abstract：The VP1 coding sequences of 11 DHAV-1 and 37 DHAV-3 isolates （spanning 2018-2019） associated with disease outbreaks were determined.Antigenic stability of representative DHAV-1 and DHAV-3 strains were study by Serum neutralization assay.We demonstrated that DHAV-1 viruses evolved into two genetic lineages，isolated strains spanning 2018-2019 were distributed into the same 1b lineages. DHAV-3 viruses exhibited two distinct lineages，majority isolated strains spanning 2018-2019 were distributed into the same 3a lineages.No Distribution differences were observed for DHAV-1 or DHAV-3 viruses.Antigenic study of representative DHAV-1 and DHAV-3 strains revealed no detectable changes in viral neutralization properties within the same serotype.Results of our experiments described here shall give novel insights into genetic properties and antigenic stability of duck hepatitis A viruses.

Key words： Duck hepatitis virus; genetic and antigenic stability