嘉寶果果皮提取物體外降糖活性研究

林寶妹 洪佳敏 邱珊蓮 鄭開斌 張帥 張少平 鄭菲艷

摘要：【目的】研究嘉寶果果皮提取物的體外降糖活性，為嘉寶果果皮中降血糖成分的開發(fā)和利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳园⒖úㄌ菫閷φ?，采用分光光度法測定嘉寶果果皮粗提物及其不同極性部位對α-葡萄糖苷酶和豬胰α-淀粉酶的抑制活性，并通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法分析各提取物的酶促動力學(xué)?！窘Y(jié)果】果皮粗提物及其正丁醇部位、乙酸乙酯部位和水部位對α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為0.005、0.029、0.020和0.242 mg/mL，均遠(yuǎn)低于阿卡波糖（IC50=11.201 mg/mL）;Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖顯示，果皮粗提物及其正丁醇部位和乙酸乙酯部位對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型均為混合型抑制，水部位為競爭性抑制，阿卡波糖為非競爭性抑制。果皮粗提物及其正丁醇部位、乙酸乙酯部位和水部位對豬胰α-淀粉酶的IC50分別為0.242、0.686、1.426和33.315 mg/mL，均高于阿卡波糖（IC50=0.184 mg/mL）;Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖顯示，果皮粗提物對豬胰α-淀粉酶的抑制作用類型為反競爭性抑制，阿卡波糖為混合型抑制?！窘Y(jié)論】嘉寶果果皮粗提物及其各極性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制活性均高于阿卡波糖，對豬胰α-淀粉酶的抑制活性均低于阿卡波糖，可在一定程度上選擇性抑制α-葡萄糖苷酶，具有減少胃腸道不良反應(yīng)的潛力，可用于天然降糖功能因子的開發(fā)。

關(guān)鍵詞： 嘉寶果果皮;極性部位;α-葡萄糖苷酶;α-淀粉酶

中圖分類號： S667.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）02-0376-09

In vitro studies on the hypoglycemic effect of

jaboticaba peel extract

LIN Bao-mei， HONG Jia-min， QIU Shan-lian*， ZHENG Kai-bin， ZHANG Shuai，

ZHANG Shao-ping， ZHENG Fei-yan

（Institute of Subtropical Agriculture， Fujian Academy of Agricultural Sciences，? Zhangzhou， Fujian? 363005， China）

Abstract：【Objective】In order to provide a theoretical basis for the development and utilization of hypoglycemic components in jaboticaba peel， the hypoglycemic activity of the extract of jaboticaba peel was investigated in vitro. 【Method】With acarbose for the control group，the inhibitory effects on α-glucosidase and porcine pancreatic α-amylase of the crude peel extract and its different polarity fractions were tested by spectrophotometric method. Meanwhile the enzymatic kinetics of each part was analyzed by Lineweaver-Burk plot. 【Result】The results showed that the median inhibitory concentration（IC50） value of α-glucosidase of crude peel extract， n-butanol fraction， ethyl acetate fraction and water fraction were 0.005， 0.029， 0.020 and 0.242 mg/mL， respectively，which were far below the acarbose（IC50=11.201 mg/mL）. Lineweaver-Burk plot showed that the inhibitory pattern of crude peel extract， n-butanol fraction and ethyl acetate fraction on the activity of α-glucosidase were mixed inhibition， competitive inhibition in water fraction and non-competitive inhibition in acarbose. The IC50 value of crude peel extract and n-butanol fraction， ethyl acetate fraction and water fraction on porcine pancreaticα-amylase were 0.242， 0.686， 1.426 and 33.315 mg/mL， respectively， which were all above the acarbose（IC50=0.184 mg/mL）. According to the Lineweaver-Burk plot， the inhibitory effect of crude peel extract on porcine pancreatic α-amylase was anticompetitive and that of acarbose was mixed inhibition. 【Conclusion】In summary， the jaboticaba peel extract and the different polarity fractions have higher inhibitory activity on α-glucosidase than acarbose， butthe inhibitory activity on porcine pancreatic α-amylase is lower than that of acarbose. Jaboticaba peel extract can selectively inhibit α-glucosidase， which has the potential to reduce adverse reactions in the gastrointestinal tract and can be used as a natural hypoglycemic functional component.

Key words： jaboticaba peel; polarity fractions; α-glucosidase; α-amylase

Foundation item： Fujian Public Welfare Research Institutes Special Project（2018R1024-6，2019R1030-4）;Youth Innovation Group Project of Fujian Academy of Agricultural Sciences（STIT2017-3-4）;Science and Technology Innovation Project of Fujian Academy of Agricultural Sciences（PC2018-9）

0 引言

【研究意義】從植物中尋找高效、低毒或無毒的降血糖活性成分一直是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)，也是藥物研發(fā)的重要手段。植物多酚廣泛存在于水果、蔬菜、谷物等植物的根、莖、葉、果皮和種子等部位，可通過影響腸道消化酶類活性達(dá)到調(diào)節(jié)血糖的目的（陳天晴，2018）。嘉寶果（Myrciaria cauliflora Berg）是桃金娘科（Myrtaceae）擬愛神木屬（Myrciaria）果樹，果皮富含多種多酚類化合物[花青素（矢車菊素-3-葡萄糖苷和飛燕草素-3-葡萄糖苷）、沒食子單寧、黃酮醇、鞣花酸及其衍生物等]（Lima et al.，2011;Plaza et al.，2016），具有抗氧化（Araújo et al.，2013）、抗腫瘤（Wang et al.，2014）、抗炎（Machado et al.，2018）和降血脂（Quatrin et al.，2018）等多種藥理學(xué)功效。若能從嘉寶果果皮中篩選出具有降血糖活性的有效成分，對糖尿病治療藥物的研發(fā)及嘉寶果果樹資源的多元化開發(fā)和利用均具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，國內(nèi)對嘉寶果的研究主要集中在栽培技術(shù)及觀察引種表現(xiàn)方面（黃麗蓉，2015;梁海峰等，2017;只佳增等，2018），而國外學(xué)者對嘉寶果的研究多為藥理學(xué)功效。Hsu等（2016）通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，嘉寶果果皮具有改善糖尿病的作用，不僅能減少腎臟組織中炎性細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放，減輕炎癥反應(yīng)，還可通過提高抗氧化酶（超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶）活性及清除過多的活性氧，降低體內(nèi)氧化應(yīng)激水平。Lamas等（2018）將嘉寶果果皮提取液每日灌胃處理高脂飼養(yǎng)小鼠，60 d后發(fā)現(xiàn)，果皮提取液不僅可降低空腹血糖，提高組織對胰島素的敏感性，還能提高HDL-C水平，改善脂質(zhì)代謝。Quatrin等（2018）將不同劑量的嘉寶果果皮凍干粉直接添加至糖尿病大鼠飲水中，連續(xù)喂養(yǎng)8周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與高血糖組相比，高劑量組（10.8 g/L）大鼠血糖降低19%，血清中炎癥因子TNF-α的水平及轉(zhuǎn)氨酶活性均降低，肝臟肥大情況改善，證明嘉寶果果皮具有一定的保肝功能;此外，嘉寶果果皮各劑量組均可減少大鼠血漿中TG、TC、LDL-C和VLDL-C含量，但對HDL-C含量影響較小。本課題組前期也開展了嘉寶果根、莖、葉、果皮等部位的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制作用研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嘉寶果果皮是DPPH·、ABTS+和·OH等自由基的有效清除劑，并可劑量依賴性抑制α-葡萄糖苷酶活性，對該酶的抑制作用遠(yuǎn)超常見的α-葡萄糖苷酶抑制劑——阿卡波糖（邱珊蓮等，2018）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】嘉寶果果皮具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，但有關(guān)果皮提取物對α-淀粉酶的抑制作用和降血糖組分篩選研究尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用不同極性的有機(jī)溶劑對嘉寶果果皮粗提物進(jìn)行梯度萃取，并測定其體外抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的能力及抑制作用方式，為嘉寶果果皮的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試嘉寶果品種為沙巴，成熟果實(shí)采自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所。主要試劑：α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，G5003-100UN）、4-硝基苯-α-d-吡喃葡萄糖苷（PNPG，N1377-1G）和豬胰α-淀粉酶（V900486-100G）購自美國Sigma公司;阿卡波糖水合物（Acarbose hydrate，C25H43NO18·xH2O，A2485）購自日本東京化成工業(yè)株式會社，純度>98%;淀粉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、乙醇、正丁醇和乙酸乙酯均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為分析純。主要儀器設(shè)備：紫外可見分光光度計(jì)（L5S型，上海儀電分析儀器有限公司）、超純水機(jī)（UPW-20N型，北京歷元電子儀器有限公司）、分析天平（BS110S型，德國Sartorius集團(tuán)）、粉碎機(jī)（WBL2521H型，佛山美的集團(tuán)）、數(shù)控超聲波清洗儀（KQ-300DE，昆山市超聲儀器有限公司）、冷凍高速離心機(jī)（MIKRO-22R，德國Hettich公司）、臺式冷凍恒溫振蕩儀（THZ-C-1，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）和酶標(biāo)儀（iMARK，美國Bio-Rad）。

1. 2 嘉寶果果皮提取物不同極性部位制備

1. 2. 1 果皮粗提物制備 嘉寶果成熟果實(shí)除去果籽和果肉得到果皮，將果皮置于熱風(fēng)干燥箱內(nèi)60 ℃烘干至恒重后，于粉碎機(jī)中粉碎（28000 r/min）1 min，過40目篩;以70%乙醇為提取溶劑，取適量果皮粉末按料液比1∶60（g/mL）混勻后于28 ℃恒溫振蕩箱中180 r/min振蕩提取20 h，之后再置于超聲波清洗儀中（28 ℃、功率120 W）提取20 min，獲得嘉寶果果皮粗提物，將其于冷凍離心機(jī)中8000 r/min離心15 min，取上清液待用。

1. 2. 2 不同極性部位制備 取1.2.1中獲得的果皮粗提物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味，得到粗提物濃縮液，以超純水稀釋濃縮液至原提取液體積，按照體積比1∶1，依次以乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，合并萃取液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法除去各萃取液溶劑，以超純水或30%乙醇重新溶解濃縮液獲得果皮粗提物的乙酸乙酯部位、正丁醇部位及萃取后剩下的水部位，以每毫升提取液所含有的原材料質(zhì)量表示各極性部位質(zhì)量濃度，單位為mg/mL。

1. 3 α-葡萄糖苷酶活性抑制率測定

參照Sichaem等（2017）的方法，并稍作修改，具體如下：采用0.05 mmol/L PBS緩沖液（pH 6.8）配制0.8 U/mL的a-葡萄糖苷酶，0.2 mmol/L PBS緩沖液（pH 6.8）配制5.0 mmol/L PNPG。在96孔板中先加入10 μL嘉寶果果皮提取物或阿卡波糖樣品和10 μL a-葡萄糖苷酶，混勻后于37 ℃溫箱中孵育10 min，然后加入50 μL PNPG繼續(xù)孵育20 min，最后加入100 μL 0.2 mol/L碳酸鈉終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定其在405 nm波長處的吸光值A(chǔ)1，同時(shí)設(shè)置空白對照組A0（以超純水代替樣品）、空白溶劑對照組A2（以超純水代替樣品和反應(yīng)試劑）和樣品本底組A3（以超純水代替反應(yīng)試劑）。根據(jù)公式（1）計(jì)算a-葡萄糖苷酶活性抑制率，并計(jì)算酶活性被抑制50%時(shí)的抑制劑濃度，即半數(shù)抑制濃度（IC50）。同時(shí)，按照上述方法測定阿卡波糖質(zhì)量濃度為5～30 mg/mL時(shí)對a-葡萄糖苷酶的抑制率。

酶活性抑制率（%）=[A0-（A1-A3）]/（A0-A2）×

100? （1）

1. 4 α-葡萄糖苷酶酶促動力學(xué)分析

固定α-葡萄糖苷酶濃度（0.8 U/mL）不變，選用不同濃度（0.05、0.10、0.20、0.30和0.40 mmol/L）的PNPG為底物[S]，以阿卡波糖為對照，在阿卡波糖質(zhì)量濃度分別為1.000和2.000 mg/mL、嘉寶果果皮粗提物質(zhì)量濃度分別為0.002和0.004 mg/mL、乙酸乙酯部位質(zhì)量濃度分別為0.010和0.020 mg/mL、正丁醇部位質(zhì)量濃度分別為0.030和0.040 mg/mL、水部位質(zhì)量濃度分別為0.050和0.100 mg/mL的條件下，測定α-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)速率（V），平行測定3次，同時(shí)設(shè)空白對照組，以超純水（0 mg/mL）代替阿卡波糖或嘉寶果果皮提取物，通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法，以1/V-1/[S]作圖，對二者進(jìn)行線性擬合，并按米氏雙倒數(shù)方程[公式（2）]計(jì)算最大酶促反應(yīng)速率（Vmax）和米氏常數(shù)（Km）。可根據(jù)直線相交情況和Vmax、Km的變化情況判斷酶抑制作用類型，酶抑制劑對酶的可逆抑制作用包括競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制。若得到一組相交于Y軸的直線，Vmax不變，Km增大，則為競爭性抑制;若得到一組相交于X軸的直線，Vmax減小，Km不變，則為非競爭性抑制;若得到一組平行的直線，Vmax和Km均減小，則為反競爭性抑制（楊榮武，2012）。

[1V] = [KmVmax]×[1[S]]+[1Vmax]? ? ? ? ? ? ?（2）

1. 5 豬胰α-淀粉酶活性抑制率測定

參考Park等（2016）的方法采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）還原法，并稍作修改，具體如下：采用0.02 mol/L PBS緩沖液（pH 6.8）配制0.5 mg/mL豬胰α-淀粉酶和1.0%淀粉底物溶液。豬胰α-淀粉酶活性抑制率采用紫外可見分光光度儀測定，取200 ?L嘉寶果果皮提取物或阿卡波糖樣品，加入100 ?L a-淀粉酶，搖勻后25 ℃恒溫水浴5 min，然后加入200 ?L 1.0%淀粉底物溶液，搖勻后25 ℃恒溫水浴10 min，最后加入0.4 mL DNS，立即沸水浴5 min，自然冷卻至室溫后加入5 mL超純水稀釋，于540 nm處測量吸光值A(chǔ)1，同時(shí)設(shè)置空白對照組A0（以超純水代替樣品）、空白溶劑對照組A2（以超純水代替樣品和反應(yīng)試劑）和樣品本底組A3（以超純水代替反應(yīng)試劑）。根據(jù)公式（1）計(jì)算a-淀粉酶活性抑制率，并計(jì)算IC50。同時(shí)，按照上述方法測定阿卡波糖質(zhì)量濃度為0.030～1.000 mg/mL時(shí)，對豬胰a-淀粉酶的抑制率。

1. 6 豬胰α-淀粉酶酶促動力學(xué)分析

固定豬胰α-淀粉酶質(zhì)量濃度（0.5 mg/mL）不變，選用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.3%、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%）的淀粉溶液為底物[S]，以阿卡波糖為對照，在阿卡波糖質(zhì)量濃度分別為0.100和0.200 mg/mL、嘉寶果果皮粗提物質(zhì)量濃度分別為0.200和0.400 mg/mL的條件下，測定α-淀粉酶的V，平行測定3次，同時(shí)設(shè)空白對照組，以超純水（0 mg/mL）代替阿卡波糖或嘉寶果果皮提取物，通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法，以1/V-1/[S]作圖，對二者進(jìn)行線性擬合，并按米氏雙倒數(shù)方程[公式（2）]計(jì)算Vmax和Km，判斷酶抑制作用類型。

1. 7 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007計(jì)算各參數(shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，并繪制回歸曲線。

2 結(jié)果與分析

2. 1 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

由圖1可知，阿卡波糖質(zhì)量濃度在5～30 mg/mL范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與α-葡萄糖苷酶抑制率呈非線性關(guān)系，即隨著阿卡波糖質(zhì)量濃度的增加，抑制率起始升高較快，隨后變緩。以質(zhì)量濃度對α-葡萄糖苷酶抑制率擬合曲線，為對數(shù)函數(shù)型曲線，R2為0.9994，曲線擬合度好。根據(jù)回歸曲線y=21.547ln（x）-2.058計(jì)算得到阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶的IC50為11.201 mg/mL。

2. 2 果皮粗提物及其不同極性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

嘉寶果果皮粗提物及其不同極性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制作用見表1。果皮粗提物及其不同極性部位對α-葡萄糖苷酶均具有較好的抑制活性，在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，抑制率均可達(dá)90%以上。以不同質(zhì)量濃度和α-葡萄糖苷酶抑制率擬合曲線，可得到擬合度高的對數(shù)曲線，0.9900≤R2≤0.9938。由表1可知，果皮粗提物及其不同極性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制能力大小排序?yàn)?0%乙醇粗提物（IC50=0.005 mg/mL）>乙酸乙酯部位（IC50=0.020 mg/mL）>正丁醇部位（IC50=0.029 mg/mL）>水部位（IC50=0.242 mg/mL）。乙酸乙酯部位的極性小于正丁醇部位，但其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用略強(qiáng)于正丁醇部位，果皮粗提物及其3個(gè)不同極性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制作用均強(qiáng)于阿卡波糖（IC50=11.201 mg/mL），表現(xiàn)出極強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

2. 3 α-葡萄糖苷酶酶促動力學(xué)分析結(jié)果

2. 3. 1 70%乙醇粗提物對α-葡萄糖苷酶的酶促動力學(xué) 固定α-葡萄糖苷酶濃度，測定不同PNPG底物濃度[S]下的V，以1/V-1/[S]作圖，得到a-葡萄糖苷酶在不添加或添加不同質(zhì)量濃度嘉寶果果皮粗提物的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，如圖2-A所示，得到一組相交于第三象限的直線。根據(jù)公式（2）可計(jì)算出不同質(zhì)量濃度的果皮粗提物對a-葡萄糖苷酶抑制的Km和Vmax，如表2所示，隨著嘉寶果果皮粗提物質(zhì)量濃度的增加，酶促反應(yīng)Km和Vmax均減小，可見嘉寶果果皮粗提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型為混合型抑制，需對提取物的不同極性部位分別進(jìn)行酶促動力學(xué)分析，進(jìn)一步探究果皮粗提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型。

2. 3. 2 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的酶促動力學(xué)

如圖2-B所示，a-葡萄糖苷酶在不添加或添加1.000和2.000 mg/mL阿卡波糖時(shí)的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖為一組近似相交于X軸的直線。由表2可知，隨著阿卡波糖質(zhì)量濃度的增加，a-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)Vmax減小，Km近似不變，可見阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型為非競爭性抑制。

2. 3. 3 果皮粗提物不同極性部位對α-葡萄糖苷酶的酶促動力學(xué) 固定α-葡萄糖苷酶濃度，測定不同PNPG底物濃度[S]下的V，以1/V-1/[S]作圖，得到a-葡萄糖苷酶在不添加或添加嘉寶果果皮粗提物3個(gè)極性部位時(shí)的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，如圖3所示，得到3組相互交叉的直線，其中添加果皮粗提物正丁醇部位（圖3-A）和乙酸乙酯部位（圖3-B）的雙倒數(shù)直線均相交于第三象限，而添加粗提物水部位（圖3-C）的雙倒數(shù)直線相交于Y軸。根據(jù)公式（2）可計(jì)算出不同質(zhì)量濃度的各極性部位對a-葡萄糖苷酶抑制的Km和Vmax，如表3所示，隨著果皮粗提物正丁醇部位和乙酸乙酯部位質(zhì)量濃度的增加，酶促反應(yīng)Km和Vmax均減小，可見果皮粗提物正丁醇部位和乙酸乙酯部位對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型均為混合型抑制，而不同質(zhì)量濃度的粗提物水部位其酶促反應(yīng)的Vmax不變，Km增大，表明水部位對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型為競爭性抑制。

2. 4 阿卡波糖對豬胰α-淀粉酶的抑制活性

由圖4可知，在阿卡波糖質(zhì)量濃度0.030～1.000 mg/mL范圍內(nèi)，以質(zhì)量濃度為X軸、豬胰α-淀粉酶抑制率為Y軸，獲得對數(shù)回歸曲線y=25.300ln（x）+92.895（R2=0.9878），經(jīng)計(jì)算得到阿卡波糖抑制豬胰α-淀粉酶的IC50為0.184 mg/mL。

2. 5 果皮粗提物及其不同極性部位對豬胰α-淀粉酶的抑制活性

由表4可知，在試驗(yàn)所設(shè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，嘉寶果果皮粗提物及其不同極性部位對豬胰α-淀粉酶均具有一定的抑制作用，且其抑制效果與質(zhì)量濃度間呈良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，均為對數(shù)曲線，0.9820≤R2≤0.9905，曲線擬合度較好，即嘉寶果果皮粗提物及其不同極性部位對α-淀粉酶的抑制作用不隨質(zhì)量濃度的增加不斷增強(qiáng)，而是逐漸趨于平穩(wěn)。果皮粗提物及其不同極性部位對豬胰α-淀粉酶的抑制能力大小排序?yàn)?0%乙醇粗提物（IC50=0.242 mg/mL）>正丁醇部位（IC50=0.686 mg/mL）>乙酸乙酯部位（IC50=1.426 mg/mL）>水部位（IC50=33.315 mg/mL）。

2. 6 豬胰α-淀粉酶酶促動力學(xué)分析結(jié)果

2. 6. 1 70%乙醇粗提物對α-淀粉酶的酶促動力學(xué)

在酶反應(yīng)體系中，保持豬胰α-淀粉酶質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL不變的情況下，測定空白對照組及果皮粗提物添加組（0.200和0.400 mg/mL）在底物淀粉不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)[S]下的V，以1/V-1/[S]作圖，得到一組近似平行的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)直線圖，如圖5-A所示。根據(jù)公式（2）可計(jì)算出不同質(zhì)量濃度的果皮粗提物對a-淀粉酶抑制的Km和Vmax，如表5所示，隨著果皮粗提物質(zhì)量濃度的增加，酶促反應(yīng)Km和Vmax均減小，可見果皮粗提物對α-淀粉酶的抑制作用類型為反競爭性抑制。由于果皮粗提物對豬胰α-淀粉酶的抑制作用方式只有反競爭性抑制一種，故未對其不同極性組分做進(jìn)一步分析。

2. 6. 2 阿卡波糖對α-淀粉酶的酶促動力學(xué) 為確定阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制類型，固定α-淀粉酶的質(zhì)量濃度（0.5 mg/mL），測定空白對照組及阿卡波糖添加組（0.100和0.200 mg/mL）在底物淀粉不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)[S]下的V，以1/V-1/[S]作圖。如圖5-B所示，a-淀粉酶在不添加或添加0.100和0.200 mg/mL阿卡波糖時(shí)的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖為一組相交于第三象限的直線。由表5可知，a-淀粉酶酶促反應(yīng)的Km和Vmax均隨阿卡波糖質(zhì)量濃度增加而減小，說明阿卡波糖對a-淀粉酶的抑制作用類型為混合型抑制。

3 討論

人體攝入碳水化合物中的淀粉和多糖在胰α-淀粉酶的作用下分解為寡聚糖，腸道中的α-葡萄糖苷酶可進(jìn)一步水解寡聚糖為單糖，單糖由腸道吸收進(jìn)入血液后血糖升高，α-葡萄糖苷酶抑制劑可抑制位于小腸上皮的α-葡萄糖苷酶，使淀粉類分解為葡萄糖的速度減慢，從而減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。但α-葡萄糖苷酶抑制劑引起的胃腸道不良反應(yīng)也限制了阿卡波糖等藥物的應(yīng)用（Pranprawit et al.，2015），開發(fā)既能有效抑制碳水化合物水解吸收，又能減少腹脹、腹瀉等胃腸道不良反應(yīng)的α-葡萄糖苷酶抑制劑可促進(jìn)降糖藥的發(fā)展應(yīng)用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，嘉寶果果皮對α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的抑制作用，抑制活性甚至超過了阿卡波糖（邱珊蓮等，2018），但尚未研究其對α-淀粉酶抑制活性，且前期研究均采用嘉寶果果皮粗提物，未對酶抑制活性部位進(jìn)行篩選。

本研究采用不同極性有機(jī)溶劑依次萃取嘉寶果果皮粗提物，獲得粗提物正丁醇部位、乙酸乙酯部位和水部位，并分別測定其對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性。結(jié)果顯示，果皮粗提物的α-葡萄糖苷酶抑制活性最強(qiáng)，乙酸乙酯部位和正丁醇部位次之，水部位最弱;在α-淀粉酶活性抑制方面，果皮粗提物與阿卡波糖的抑制作用相當(dāng)，其次為正丁醇部位和乙酸乙酯部位，水部位最弱。有研究報(bào)道，多酚能與蛋白結(jié)合，改變蛋白質(zhì)構(gòu)型從而影響蛋白的生理功能（張莉等，2018）。嘉寶果果皮中多酚含量達(dá)556.6 g GAE/kg（Leite-Legatti et al.，2012），因此能較好地抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶等蛋白酶活性。但果皮不同極性部位中多酚類物質(zhì)的種類、結(jié)構(gòu)和含量存在一定差異，與酶蛋白的結(jié)合量、強(qiáng)弱、部位和作用力類型等不同，導(dǎo)致各極性部位對酶的抑制活性存在差異，以中低極性部位的抑制活性強(qiáng)，極性最大的水部位抑制兩種酶的效果均最差，說明果皮中中低極性的多酚類物質(zhì)具有更好的酶抑制活性。此外，蛋白酶的種類不同，也會影響提取物的抑制活性。本研究中，嘉寶果果皮粗提物及其各極性部位對α-葡萄糖苷酶的抑制作用（0.005 mg/mL≤IC50≤0.242 mg/mL）強(qiáng)于阿卡波糖（IC50=11.201 mg/mL），對α-淀粉酶的抑制作用（0.242 mg/mL≤IC50≤33.315 mg/mL）弱于阿卡波糖（IC50=0.184 mg/mL）。該研究結(jié)果與多種植物提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制能力結(jié)果相似，如金蕎麥（Rhizoma fagopyri dibotryis）根莖及其不同極性部位（張兆遠(yuǎn)和阮洪生，2017）、芡（Euryale ferox）種皮（伍城穎等，2015）和金露梅（Potentilla fruticosa）枝葉（李美華等，2018）等提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均強(qiáng)于阿卡波糖，對α-淀粉酶活性的抑制作用均弱于阿卡波糖。但金露梅枝葉提取物和蘋果多酚提取物（劉杰超等，2011）對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的IC50較接近，即二者對兩種酶的選擇性較差;而當(dāng)嘉寶果果皮粗提物及其各極性部位對α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)抑制活性時(shí)，對α-淀粉酶幾乎無抑制活性。據(jù)報(bào)道，α-葡萄糖苷酶抑制劑所引起的胃腸道不良反應(yīng)可能是過度抑制α-淀粉酶活性引起的（Al-Zuhair et al.，2010），而嘉寶果果皮粗提物及其各極性部位在低濃度時(shí)即可有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，抑制單糖的水解產(chǎn)生，同時(shí)對α-淀粉酶僅有輕微抑制，可避免大量未消化淀粉在腸道發(fā)酵產(chǎn)氣，引起腹部不適。

酶促動力學(xué)研究結(jié)果顯示，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為非競爭性抑制，該結(jié)果與呂歡等（2012）的研究結(jié)果一致。嘉寶果果皮粗提物的正丁醇部位和乙酸乙酯部位對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為混合型抑制，說明正丁醇部位和乙酸乙酯部位中降糖組分較多且作用方式不同，需繼續(xù)分離純化，才能進(jìn)一步確定其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用方式;水部位對α-葡萄糖苷酶的抑制作用方式為競爭性抑制，即水部位中的降糖活性成分可競爭性抑制底物PNPG與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合，作用方式與阿卡波糖不同，推測該活性物質(zhì)極性較強(qiáng)，且空間結(jié)構(gòu)可能與PNPG較接近。阿卡波糖對豬胰α-淀粉酶的抑制作用為混合型抑制，即阿卡波糖可與豬胰α-淀粉酶多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合后抑制酶的活性，而嘉寶果果皮粗提物對豬胰α-淀粉酶的抑制作用為反競爭性抑制，即果皮粗提物中的活性成分不能與游離α-淀粉酶結(jié)合而是與酶—底物復(fù)合物結(jié)合，說明果皮提取物中能抑制α-淀粉酶的組分較單一或是結(jié)構(gòu)相似的一類化合物，結(jié)合果皮粗提物對豬胰α-淀粉酶的抑制活性推測該類化合物屬中極性化合物且分子量較接近。

嘉寶果果皮粗提物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用極強(qiáng)，IC50遠(yuǎn)低于阿卡波糖，對α-淀粉酶的抑制作用與阿卡波糖接近;果皮粗提物按照極性分級后，各極性部位仍表現(xiàn)出對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的選擇性，說明嘉寶果果皮粗提物及其不同極性部位均具備降低阿卡波糖引起的胃腸道不良反應(yīng)的潛力。Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法明確嘉寶果果皮及其不同極性對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用方式，初步闡明嘉寶果果皮酶抑制機(jī)制，補(bǔ)充嘉寶果果皮作為降糖功能因子開發(fā)的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

嘉寶果果皮粗提物及其不同極性部位對α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出強(qiáng)抑制性時(shí)，對α-淀粉酶的抑制作用較小，對開發(fā)具有選擇性的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有一定的指導(dǎo)意義。

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