崔 筱,劉 芹,段亞魁，康源春,孔維威,張玉亭,袁瑞奇,孔維麗

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，河南 鄭州 450002)

平菇(Pleurotusostreatus)，又名側(cè)耳、糙皮側(cè)耳、蠔菇、黑牡丹菇，臺(tái)灣又稱秀珍菇，在分類學(xué)上屬真菌門(Eumycota;Mycobionta)、擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、傘菌目(Agaricales)、側(cè)耳科(Pleurotaceae)、側(cè)耳屬(Pleurotus)[1]，是一種常見的灰色食用菇。據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)(2017年)，國(guó)內(nèi)平菇2016年總產(chǎn)量約600萬t，在全國(guó)各地均有種植，河南省是全國(guó)平菇重點(diǎn)產(chǎn)區(qū)，年產(chǎn)量約100萬t，栽培面積分布全省。由于不同區(qū)域引種混亂，隨意命名，導(dǎo)致生產(chǎn)中平菇菌株同名異物和同物異名現(xiàn)象嚴(yán)重。收集生產(chǎn)中常用菌株，對(duì)平菇菌株進(jìn)行有效地分類和鑒定是平菇新品種選育的基礎(chǔ)和前提。在自然界中微生物與微生物之間拮抗現(xiàn)象普遍存在，是一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)過程，具有防止遺傳上明顯不同的個(gè)體間融合的作用，以保持個(gè)體遺傳上的穩(wěn)定性[2]。拮抗反應(yīng)試驗(yàn)可用于菌株之間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的預(yù)測(cè)，在真菌分類學(xué)上被廣泛應(yīng)用[3]。但拮抗試驗(yàn)只能將有拮抗反應(yīng)的菌株分為不同菌株，卻不能將沒有拮抗反應(yīng)的菌株視為相同菌株，甚至很難說沒有拮抗反應(yīng)的菌株親緣關(guān)系近，有的不同種或不同屬之間的菌株也可能沒有拮抗反應(yīng)，因此，拮抗測(cè)定僅僅是菌種鑒定的一種輔助手段，需要和其他鑒定手段相配合。核糖體第1轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer 1,ITS1)是位于18S rRNA和5.8S rRNA基因之間的非編碼間隔區(qū)，在種內(nèi)由于基因的流動(dòng)而經(jīng)常表現(xiàn)出很高的同源性，在種間則保持著各種程度的變異，變異的多少能夠反映生物進(jìn)化上屬內(nèi)種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，且具有快速、準(zhǔn)確、微量、靈敏度高、程序簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已作為一種分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于真菌的分類鑒定、檢測(cè)和病害診斷[4-5]。如劉華晶等[6]利用ITS 標(biāo)記對(duì)黑龍江省采集的33個(gè)野生黑木耳菌株和8個(gè)黑龍江省常見栽培菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析和系統(tǒng)發(fā)育研究。本研究對(duì)54個(gè)平菇菌種通過拮抗和ITS試驗(yàn)進(jìn)行了分類和鑒定，旨在為以后的平菇選育工作提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

供試平菇菌株54株，其中野生菌株11株，栽培菌株43株(表1)。A16、A25、A43、A46引自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院；A4、A10、A35、A54引自江蘇天達(dá)食用菌有限公司；A7、A19、A34、A51引自新鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)科學(xué)院；A48引自商丘農(nóng)業(yè)科學(xué)院；A20、A24、A29、A31、A40為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌中心保藏菌株；A27、A49、A50、A52為自育品種。A2、A3、A6、A9、A12、A13、A14、A15、A18、A21、A22為野生型菌株，其余均從生產(chǎn)中采集分離。

1.2 供試培養(yǎng)基

母種PDA培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；栽培培養(yǎng)基：棉籽殼98%、石灰2%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 栽培評(píng)價(jià)試驗(yàn) 按照配方制作栽培菌袋，菌袋規(guī)格為14 cm×28 cm×0.05 cm聚丙烯袋，一端套環(huán)，每袋培養(yǎng)料質(zhì)量500 g，高壓滅菌后，在套環(huán)一端接種，25 ℃培養(yǎng)，菌絲滿袋后，去掉套環(huán)，開口出菇，保持棚內(nèi)溫度10～28 ℃、相對(duì)濕度 80%～95%、光照150～200 lx、CO2質(zhì)量濃度1 178.57～1 571.42 mg/m3，子實(shí)體七成熟采收，觀察記載子實(shí)體顏色。

表1 供試平菇菌株Tab.1 The tested strains of Pleurotus ostreatus

1.3.2 拮抗試驗(yàn) 以栽培評(píng)價(jià)分類的54個(gè)平菇菌株為材料，用直徑3 mm的打孔器打取各菌株種塊于90 mm培養(yǎng)皿內(nèi)對(duì)峙培養(yǎng)，每皿放置8個(gè)種塊，種塊間距1.0 cm，每個(gè)菌株重復(fù)3次，于25 ℃培養(yǎng)7 d，按照拮抗試驗(yàn)(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn))的方法觀察菌株間拮抗反應(yīng)的結(jié)果，記錄并進(jìn)行聚類分析。

1.3.3 ITS序列分析

1.3.3.1 DNA的提取與檢測(cè) 將各參試菌株在相同條件下接種于PDA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行淺層培養(yǎng)，培養(yǎng)量以每個(gè)菌株可以做3個(gè)平行試驗(yàn)為準(zhǔn)?；蚪MDNA提取方法參考閆燕等[7]的CTAB方法并有一定改動(dòng)。將5 mm平菇菌塊接種到PDA培養(yǎng)基中，于25 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，7 d后收集菌絲，放入燒過后的潔凈研缽中，倒入適量液氮，迅速充分研磨菌絲體直至呈細(xì)粉末狀，轉(zhuǎn)入EP管。加入600 μL 預(yù)熱到 65 ℃的CTAB提取液，充分振蕩，放入65 ℃水浴鍋中1～2 h。在此期間每隔10 min上下顛倒混勻EP管一次，將上述加有菌體粉末的CTAB混合液冷卻至室溫，然后用V酚∶V氯仿∶V異戊醇=25∶24∶1和V氯仿∶V異戊醇=24∶1的溶液各抽提1次，用DNA 定量?jī)x測(cè)定樣品DNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 PCR反應(yīng)引物、體系及程序 ITS1序列PCR擴(kuò)增正向引物為5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，反向引物為5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′，引物由武漢普奈斯生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25～27個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，使產(chǎn)物延伸完整，4 ℃保存。PCR反應(yīng)總體系為25 μL，包括5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，Q5 DNA 聚合酶0.25 μL，模板DNA 50～100 ng,ddH2O 9.75 μL。

1.3.3.3 DNA序列測(cè)定 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段，用Axygen 凝膠回收試劑盒回收目的片段。在MiSeq機(jī)器上利用MiSeq Reagent Kit V3進(jìn)行2×300 bp的雙端測(cè)序。

1.3.3.4 ITS序列分析 對(duì)測(cè)序的54個(gè)DNA序列用 Qiime軟件進(jìn)行OTU聚類，將OTU代表序列用Mafft對(duì)齊，然后用ClustalX 2.1軟件進(jìn)行序列同源性比較。運(yùn)用MAGA X軟件基于鄰接法(Neighbor-joining method,NJ 法)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 平菇栽培評(píng)價(jià)結(jié)果

根據(jù)子實(shí)體顏色，將54個(gè)菌株分為兩大類:深灰黑色和灰白色系列，結(jié)果見表2、圖1—2。

2.2 平菇拮抗試驗(yàn)結(jié)果

以顏色分類為基礎(chǔ)，分別對(duì)2個(gè)顏色系列54個(gè)菌株做拮抗檢測(cè)(圖3)，共設(shè)計(jì)拮抗組合1 431組，結(jié)果表明，拮抗現(xiàn)象不明顯的有47組，占3.28%，初步將31個(gè)菌株聚成9個(gè)類群，其余23個(gè)菌株與其他菌株間拮抗現(xiàn)象比較明顯，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ組中，組內(nèi)各個(gè)菌株間沒有顯著拮抗反應(yīng)現(xiàn)象，表明這些菌株親緣關(guān)系較近，可能起源于同一菌株，結(jié)果見表3。

2.3 ITS序列分析結(jié)果

2.3.1 PCR試驗(yàn)結(jié)果 54個(gè)平菇樣品經(jīng) PCR 擴(kuò)增都分別得到約280 bp的目的條帶(圖4),將測(cè)序獲得的序列于NCBI 進(jìn)行在線比對(duì)分析，證明其是5.8S rDNA區(qū)序列。

表2 供試菌株子實(shí)體顏色Tab.2 Fruit body color of tested strains

圖1 深灰黑色平菇材料部分出菇試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Partial fruiting experiment of dark grey and black varieties

圖2 灰白色平菇材料部分出菇試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Partial fruiting experiment of grey white varieties

圖3 平菇部分拮抗試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Partial antagonistic test results of Pleurotus ostreatus

表3 平菇拮抗菌株分組結(jié)果
Tab.3 Grouping results ofPleurotusostreatusantagonistic strains

組別Group菌株編號(hào)Strainnumber組別Group菌株編號(hào)Strainnumber組別Group菌株編號(hào)StrainnumberⅠA20A37A41A42A38A54A45ⅤA1ⅧA8ⅡA7A26A17A30A28A32ⅢA10A46A43A11ⅥA16A45A29A53ⅨA25A47ⅦA23A34ⅣA4A31A5A39

M.Marker—1 000、700、500、400、300、200 bp圖4 54個(gè)平菇樣品rDNA ITS1區(qū)序列PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果Fig.4 PCR results of rDNA ITS1 regions of 54 kinds of Pleurotus ostreatus

2.3.2 ITS 序列及組成分析 經(jīng)對(duì)位排列，獲得54株菌的ITS序列長(zhǎng)度為280 bp，與 GenBank 數(shù)據(jù)庫中平菇菌種的ITS序列相似度為99%以上，在種的水平上證明供試菌株為平菇。經(jīng)分析可知，54個(gè)平菇樣品rDNA ITS1序列的堿基組成比較接近(表4)，整個(gè)堿基組成中，除A5外，其余53個(gè)樣品A+T含量均高于C+G含量；單個(gè)堿基組成中，除A5外，其余53個(gè)樣品T含量較高，為31%～33%，C含量較低，為20%～21%。

表4 54個(gè)平菇樣品rDNA ITS1序列的堿基組成Tab.4 Base composition of rDNA ITS1 sequences of 54 kinds of Pleurotus ostreatus %

2.3.3 分子系統(tǒng)進(jìn)化分析 為了明確54個(gè)平菇樣品的分子進(jìn)化關(guān)系，將測(cè)序得到的rDNA ITS1序列經(jīng)ClustalX 2.1軟件進(jìn)行多序列比對(duì)重排后，運(yùn)用MAGA X軟件基于NJ法構(gòu)建平菇rDNA ITS1序列的分子進(jìn)化系統(tǒng)樹(圖5)。從系統(tǒng)進(jìn)化樹的數(shù)值分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，54個(gè)平菇樣品可以聚為2個(gè)大類，2個(gè)大類遺傳關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)、獨(dú)立進(jìn)化。其中，第一大類中，A33與A13聚為一小類，與A40、A22、A48存在一定的親緣關(guān)系；A42與A20聚為一小類，與A35、A24、A14存在親緣關(guān)系；A47與A29聚為一小類，A10與A11聚為一小類，且兩小類之間存在一定的親緣關(guān)系；A38與A5聚為一小類，A37與A4聚為一小類，且兩小類之間存在一定的親緣關(guān)系；A44與A12聚為一小類，A21與A9聚為一小類，且這兩小類與A18、A6、A15、A3之間存在一定的親緣關(guān)系。第二大類中，A43與A39聚為一小類；A23與A16聚為一小類，A54與A45聚為一小類，A31與A8聚為一小類且與A41存在一定的親緣關(guān)系；A50與A49聚為一小類且與A52、A27、A25存在一定的親緣關(guān)系；A28與A30聚為一小類，A19與A17聚為一小類，且與A32、A53存在一定的親緣關(guān)系；A51與A7聚為一小類，A36與A26聚為一小類，A46與A1聚為一小類，且與A2存在一定的親緣關(guān)系。根據(jù)ITS序列進(jìn)化分析，可將收集到的54株菌種定為36個(gè)菌株，彼此之間存在親緣關(guān)系，與初步拮抗試驗(yàn)結(jié)果存在一定的差異。

圖5 54個(gè)平菇菌株的分子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The molecular phylogenetic tree of 54 strains of Pleurotus ostreatus

3 結(jié)論與討論

根據(jù)栽培試驗(yàn)結(jié)果，按照顏色將54個(gè)菌株分為深色系列和淺色系列。按照顏色的聚類，在2個(gè)系列之間做拮抗分析，結(jié)果表明，根據(jù)拮抗現(xiàn)象的有無，初步將54個(gè)株菌株聚成32個(gè)類群。進(jìn)一步通過ITS序列分析發(fā)現(xiàn)，54個(gè)供試菌的ITS序列長(zhǎng)度為280 bp，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的ITS 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其是5.8S rDNA區(qū)序列，與平菇菌種的相似度為99%以上。進(jìn)化樹分析表明，54個(gè)平菇樣品可以聚為2個(gè)大類，2個(gè)大類遺傳關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)、獨(dú)立進(jìn)化，可將收集到的54株菌種定為36個(gè)差異菌株，但真菌ITS區(qū)域變異較快，可提供比較豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，因此可作為一種分子標(biāo)記用于探討真菌種內(nèi)變異和屬內(nèi)種間分子系統(tǒng)關(guān)系，可作為拮抗法鑒定差異不明顯菌株間的補(bǔ)充鑒定方法，拮抗試驗(yàn)可以作為ITS序列菌種鑒定的前期輔助手段。

平菇是重要的食用菌栽培種之一，由于其種類多、個(gè)體多態(tài)性明顯，易受培養(yǎng)條件和其他因素的影響，僅根據(jù)形態(tài)學(xué)進(jìn)行分類并不能建立穩(wěn)定的分類系統(tǒng)，給其分類鑒定帶來一定的難度[8]，拮抗試驗(yàn)是菌株體細(xì)胞之間不親和的表現(xiàn)，在輔助鑒定分析親緣關(guān)系中得到普遍應(yīng)用，如秀珍菇[9]、杏鮑菇[10]、真姬菇[11]、香菇[12]等菌種的鑒定及親緣關(guān)系分析，但該方法也存在一定的局限性，因?yàn)橛H和菌株可能完全相同就是一個(gè)菌株，也可能存在遺傳差異。ITS1為核基因組序列，由于該序列屬于非編碼的間隔區(qū)，沒有自然選擇的壓力，使得該序列成為較好的分子系統(tǒng)學(xué)分析片段。

本研究通過拮抗試驗(yàn)對(duì)54個(gè)平菇菌株進(jìn)行了初步鑒定，結(jié)果表明，共設(shè)計(jì)拮抗組合1 431組，拮抗現(xiàn)象不明顯的有47組，有1 384個(gè)配對(duì)(96.72%)形成拮抗反應(yīng)，其中Ⅰ—Ⅸ組內(nèi)的菌株之間拮抗不明顯，可以認(rèn)定為9個(gè)不同的菌株，其余23個(gè)菌株與之拮抗明顯，最終將54個(gè)菌株初步鑒定為32個(gè)不同菌株。后經(jīng)ITS序列進(jìn)一步鑒定表明，ITS序列將54個(gè)菌株最終鑒定為36個(gè)菌株，除拮抗試驗(yàn)的Ⅵ—Ⅸ組之外，其他組合與拮抗試驗(yàn)分析基本一致，這說明拮抗試驗(yàn)雖然是一種簡(jiǎn)易的鑒定方法，但受主觀因素影響較大，特別是在統(tǒng)計(jì)過程中對(duì)拮抗強(qiáng)度的弱與無之間的界定不是很準(zhǔn)確，另外，拮抗線的有無及程度的強(qiáng)弱還受培養(yǎng)基成分的影響[13]，因此，拮抗反應(yīng)只能作為鑒定菌種間親緣關(guān)系的一個(gè)輔助手段，對(duì)于拮抗現(xiàn)象明顯的菌株可認(rèn)定是不同菌株，對(duì)于拮抗現(xiàn)象不明顯的菌株，可通過ITS法對(duì)其進(jìn)一步鑒定認(rèn)證。