郝俊芳,張英濤,邢廣旭,王方雨
(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州450002;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院禽病研究中心,四川 成都611130;3.河南省科學(xué)院 生物研究所有限責(zé)任公司,河南 鄭州450008)
核酸適配體指具有特定三維空間結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸(DNA或RNA),它能夠與多種靶標(biāo)物結(jié)合[1],包括離子、小分子、蛋白質(zhì)和完整的活細(xì)胞等[2-4]。與體內(nèi)天然的抗體相比,適配體可以化學(xué)合成并具有許多優(yōu)點(diǎn),如分子質(zhì)量小、免疫原性低、不依賴于動(dòng)物或細(xì)胞并且可以進(jìn)行多種修飾,被稱為化學(xué)抗體[5-7]。鑒于適配體優(yōu)越的性能,其已作為一種新型的生物識(shí)別工具,在藥物殘留、疾病診斷、食品安全和分析化學(xué)等領(lǐng)域的研究備受關(guān)注[8-11]。然而,由于適配體篩選過(guò)程的繁瑣性,使得適配體的可用數(shù)量非常有限。因此,解決各種靶標(biāo)的高效篩選問(wèn)題是加速核酸適配體廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵步驟。
核酸適配體篩選過(guò)程是利用體外篩選技術(shù)——指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX),從隨機(jī)核酸小分子組合文庫(kù)中篩選出靶標(biāo)適配體的一個(gè)分離和擴(kuò)增的迭代過(guò)程[12-14]。目前,核酸適配體已經(jīng)發(fā)展多種篩選方法,包括硝酸纖維素膜-SELEX、磁珠-SELEX、微流控-SELEX和毛細(xì)管電泳-SELEX[14]。傳統(tǒng)的SELEX主要缺點(diǎn)是篩選過(guò)程繁瑣、耗時(shí)耗力、重復(fù)性差,往往需要多輪篩選才能得到高親和力的適配體,制約了適配體的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用[15-16]。目前,適配體篩選無(wú)法實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線自動(dòng)化監(jiān)測(cè),且針對(duì)不同靶標(biāo)類型沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化的程序。如何高效率的分離出具有高親和性和特異性的適配體是目前研究的熱點(diǎn),也是適配體發(fā)展面臨的主要問(wèn)題。
局域表面等離子體共振(LSPR)是一種新型的分析工具,主要用于分析大小分子之間的相互作用,如蛋白質(zhì)與小分子藥物、蛋白質(zhì)與核酸等[17-18]。LSPR的納米金芯片具有獨(dú)特的化學(xué)和光學(xué)性質(zhì)[19],在可見(jiàn)光范圍內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)烈的共振吸收峰,使得金納米粒子周圍的局部折射率高度敏感[20]。傳感器芯片上的納米金粒子(AuNPs 1.5 mm2)小于LSPR的連續(xù)金膜,可以通過(guò)EDC/NHS法將靶標(biāo)分子固定在芯片表面。LSPR最顯著的優(yōu)勢(shì)在于樣品無(wú)需進(jìn)行任何標(biāo)記即可實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè),具有操作簡(jiǎn)便和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[21]。LSPR用于測(cè)定親和力的研究已有報(bào)道[22-23]?;贚SPR的技術(shù)優(yōu)勢(shì),以鏈霉親和素(SA)傳感器芯片作為固定靶標(biāo),通過(guò)測(cè)定流過(guò)芯片表面不同濃度的核酸文庫(kù)來(lái)分析SA結(jié)合的適配體(SBA)的親和力,以期為核酸適配體的快速篩選提供新的途徑。
ssDNA初始文庫(kù)(L2)和上下游引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司,具體序列見(jiàn)表1;Open LSPR和親和素傳感器芯片購(gòu)自北京普瑞麥迪公司;毛細(xì)管電泳(CE)G7100A plus和熔融石英毛細(xì)管購(gòu)自美國(guó)Agilent Technologies公司;鏈霉親和素購(gòu)自上海普欣公司;牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自北京百奧萊博公司;PremixTaq和pMD19-T Vector購(gòu)自大連寶生物公司;膠回收試劑盒和PCR純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。所有用于LSPR和CE分析的溶液使用前均需經(jīng)0.22 μm的濾器過(guò)濾。
表1 L2庫(kù)、P1和P2引物的序列Tab.1 The sequence of L2 library,P1 and P2 primers
采用LSPR-SELEX技術(shù)篩選核酸適配體的流程見(jiàn)圖1。首先,將吸附在LSPR芯片上的核酸文庫(kù)洗脫收集。其次,將其進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集并作為二級(jí)文庫(kù),直至篩選出高親和力的適配體。隨后,經(jīng)細(xì)菌克隆、測(cè)序和化學(xué)合成得到SBA適配體。最后,通過(guò)毛細(xì)管電泳鑒定LSPR-SELEX篩選得到的SBA。
1.2.1 LSPR-SELEX技術(shù)篩選SA的適配體 首先,將ssDNA初始文庫(kù)(L2)進(jìn)行變性處理。取ssDNA干粉用ddH2O溶解并稀釋至100 μmol/L。經(jīng)95 ℃條件下水浴10 min破壞核酸分子間形成的聚合物,然后冰浴10 min,-20 ℃保存。其次,在LSPR開(kāi)始之前將運(yùn)行緩沖液PBS(10 mmol/L)以150 μL/min的流速運(yùn)行約10 min,直至信號(hào)達(dá)到穩(wěn)定基線。接著,將ssDNA溶液按預(yù)先設(shè)計(jì)好的濃度用PBS進(jìn)行稀釋,并且每個(gè)樣品取250 μL注射到儀器,以20 μL/min的流速與芯片相互作用5 min。然后,以150 μL/min的流速?zèng)_洗芯片5 min用于沖洗未結(jié)合或結(jié)合力弱的ssDNA分子。最后注入250 μL解離緩沖液NaOH(10 mmol/L),以20 μL/min的流速洗脫并收集特異性結(jié)合SA的適配體。在每輪篩選后,使用Trace Drawer數(shù)據(jù)軟件分析其KD值。
1.2.2 PCR擴(kuò)增和單鏈DNA的制備 將洗脫和收集的ssDNA分子作為二級(jí)文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集。優(yōu)化后的50 μL反應(yīng)體系:20 μmol/L的P1、P2各2 μL,rTaq和ssDNA文庫(kù)分別為25 μL和21 μL。PCR程序:95 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性30 s,61.7 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán);最后,72 ℃延伸2 min。通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物,并切膠回收用作模板以制備單鏈二級(jí)文庫(kù)。
不對(duì)稱PCR優(yōu)化后的反應(yīng)體系:20 μmol/L的P2 4 μL,25 μL的rTaq,模板2 μL,最后ddH2O補(bǔ)充至50 μL。以純化后的產(chǎn)物為模板制備單鏈二級(jí)文庫(kù)。
1.2.3 毛細(xì)管電泳驗(yàn)證 LSPR-SELEX篩選的核酸適配體通過(guò)毛細(xì)管電泳表征。儀器運(yùn)行之前,依次用不同的溶液(1 mol/L NaOH、ddH2O、40 mmol/L Tris-乙酸鹽)在300 s×1 Bar的壓力脈沖下,預(yù)沖洗毛細(xì)管柱5 min。注入條件為50 mBar×20 s,時(shí)間為0.2 min×20 kV。樣品瓶分別裝入SA、SBA、SA+SBA復(fù)合物(室溫孵育30 min)、BSA以及BSA+SBA復(fù)合物,每個(gè)樣品不小于200 μL,壓力進(jìn)樣50 mBar×10 s,分離電壓20 kV,分離時(shí)間20 min,使用488 nm氬離子激光器激發(fā)熒光。運(yùn)行結(jié)束后,毛細(xì)管用1 mol/L NaOH和ddH2O各沖洗10 min。
ssDNA初始文庫(kù)(L2)長(zhǎng)度為114 nt,中間部分為74 nt的隨機(jī)序列,兩端的側(cè)翼為20 nt引物位點(diǎn)。在第1輪LSPR-SELEX(圖2A)中,篩選到與SA結(jié)合的適配體SBA(命名為SBA-1),其KD值為107 μmol/L (表2)。在第2輪LSPR-SELEX(圖2B)中,SBA(命名為SBA-2)的KD值為98 nmol/L(表2)。LSPR-SELEX的結(jié)果表明,LSPR-SELEX技術(shù)在2輪的篩選中使SBA的親和力提高了1 000倍,獲得納摩爾范圍內(nèi)的適配體,將篩選到與SA結(jié)合的適配體命名為SBA。
A:第1輪LSPR-SELEX篩選SBA時(shí)得到的動(dòng)力學(xué)曲線;B:第2輪LSPR-SELEX篩選SBA時(shí)得到的動(dòng)力學(xué)曲線A:The kinetic curve obtained in the first round of LSPR-SELEX screening for SBA;B:The kinetic curve obtained in the second round of LSPR-SELEX screening for SBA圖2 通過(guò)LSPR-SELEX技術(shù)分析L2與SA結(jié)合的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 The dynamic curves of L2 and SA binding analyzed by LSPR-SELEX technology
表2 SBA與SA相互作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.2 The kinetic parameters of SBA-SA interaction
游離溶液中天然結(jié)構(gòu)的維持有利于靶標(biāo)和核酸文庫(kù)的相互作用。因此,在游離溶液中分離靶標(biāo)-適配體結(jié)合物是最理想的方法。目前,僅有CE可以在游離溶液中實(shí)現(xiàn)適配體的高效篩選[24]。基于CE的特性,驗(yàn)證經(jīng)LSPR-SELEX篩選得到的SBA,以BSA作為對(duì)照。
CE的結(jié)果表明,SBA和SA的樣品峰分別出現(xiàn)在11.37 min和6.98 min,與預(yù)期的時(shí)間相一致;與對(duì)照組相比(圖3D—圖3E),SA + SBA復(fù)合物的樣品峰出現(xiàn)在9.32 min,而BSA+SBA復(fù)合物的樣品峰,分別是位于原來(lái)的7.76 min和11.37 min,從而證實(shí)了SA與SBA之間的高親和性和特異性(圖3A—圖3C)。
將第2輪收集到的核酸庫(kù)產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上,經(jīng)轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞、測(cè)序等獲得了鏈霉親和素的核酸適配體SBA序列。由圖4可知,SBA適配體的總長(zhǎng)度為114 nt,其三維結(jié)構(gòu)為莖環(huán)狀。
A:SA(250 μg/mL)的毛細(xì)管電泳遷移圖;B:SBA適配體(150 μg/mL)的毛細(xì)管電泳遷移圖;C:SBA(75 μg/mL)+ SA(125 μg/mL)的毛細(xì)管電泳遷移圖;D:BSA(250 μg/mL)的毛細(xì)管電泳遷移圖;E:BSA(125 μg/mL)+ SBA(75 μg/mL)的毛細(xì)管電泳遷移圖A:Capillary electrophoresis migration diagram of SA(250 μg/mL);B:Capillary electrophoresis migration diagram of SBA aptamer (150 μg/mL);C:Capillary electrophoresis migration diagram of SBA(75 μg/mL)+SA(125 μg/mL);D:Capillary electrophoresis migration diagram of BSA(250 μg/mL);E:Capillary electrophoresis migration diagram of BSA(125 μg/mL)+SBA(75 μg/mL)圖3 毛細(xì)管電泳驗(yàn)證SBAFig.3 The SBA verification by capillary electrophoresis
圖4 SBA適配體的序列Fig.4 The SBA aptamer sequence
核酸適配體是一段能夠與靶標(biāo)分子高親和性、高特異性結(jié)合的單鏈寡核苷酸,具有檢測(cè)靈敏度高、成本低、易合成修飾等優(yōu)點(diǎn)。其在基礎(chǔ)研究、分子診斷以及農(nóng)產(chǎn)品及農(nóng)田環(huán)境污染監(jiān)測(cè)等諸多領(lǐng)域中展示出廣闊的應(yīng)用前景[25]。目前,隨著SELEX技術(shù)的快速發(fā)展,幾十種變體的SELEX已成功地用于開(kāi)發(fā)適配體[26-27],但大部分SELEX篩選過(guò)程較為繁瑣、耗時(shí)耗力,在一定程度上限制了核酸適配體的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。
在SELEX篩選過(guò)程中,如何快速簡(jiǎn)便地獲取與靶標(biāo)結(jié)合的核酸適配體是提高篩選效率的關(guān)鍵。KIANI等[28]使用鏈霉親和素磁珠作為固相載體,將生物素化的地高辛固定在其表面,經(jīng)過(guò)11輪篩選,得到KD值為8.2 nmol/L的地高辛適配體。LUO等[29]通過(guò)將CE餾分收集與油封相結(jié)合的方法,開(kāi)發(fā)了具有無(wú)污染的餾分收集法。研究發(fā)現(xiàn),CE-SELEX不適合篩選小分子靶標(biāo)的適配體[30],并且高離子濃度的緩沖體系會(huì)影響CE中適配體的穩(wěn)定性。ZHANG等[31]利用多功能的適配體傳感器進(jìn)行細(xì)胞表面多糖的電化學(xué)定量和肉眼跟蹤活細(xì)胞中的糖酵解抑制。LI等[32]使用一種改進(jìn)的羧基瓊脂糖磁珠-SELEX技術(shù),分離出6種針對(duì)肺癌標(biāo)志物的DNA適配體。因此,迫切需要開(kāi)發(fā)一種全新的簡(jiǎn)便、高效的核酸適配體篩選方法。
與傳統(tǒng)SELEX相比,LSPR-SELEX具有以下特征:首先,LSPR-SELEX篩選效率高,大約7 d就可以完成所有的篩選;成本低,傳感器芯片可以使用70次以上,并且每輪篩選出的適配體可以通過(guò)LSPR的Trace Drawer數(shù)據(jù)軟件精確地計(jì)算其KD值。其次,LSPR-SELEX不需要復(fù)雜的緩沖液系統(tǒng),PBS溶液可以極大地保持樣品的生物穩(wěn)定性和活性。最后,LSPR-SELEX不僅可以在短時(shí)間內(nèi)獲得高親和力的適配體,同時(shí)可以測(cè)定適配體—靶標(biāo)相互作用的結(jié)合參數(shù)[19]。重要的是,LSPR-SELEX在整個(gè)篩選過(guò)程中生物分子無(wú)需任何標(biāo)記,實(shí)時(shí)在線地監(jiān)測(cè)相互作用,在早期篩選中識(shí)別高親和力的適配體,并對(duì)緩沖液的體積、溫度和折射率的變化不敏感。本研究開(kāi)發(fā)了一種新的LSPR-SELEX篩選技術(shù),僅用2輪篩選獲得了具有納摩爾平衡解離常數(shù)的SBA適配體。CE驗(yàn)證結(jié)果表明,篩選出的SBA適配體具有高親和性和特異性??梢?jiàn),LSPR-SELEX不僅縮短核酸適配體的篩選周期,而且可以提高SELEX篩選過(guò)程的成功率。
隨著新型現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展和生物大分子功能探索的不斷深入,對(duì)篩選多種不同靶標(biāo)物的核酸適配體提出了更高的要求,迫切需要一種快速、高效、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、成本低廉的適配體篩選新方法。雖然SELEX技術(shù)目前正在不斷完善,但仍有一些技術(shù)瓶頸需要去突破。作為新型的分子識(shí)別工具,核酸適配體未來(lái)在藥物、疾病和食品等方面將發(fā)揮更加重要的作用。