呂建蘭,胡勁濤,柴樂,錢劍勝,任偉凡,全仁夫

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬江南醫(yī)院,蕭山 311200)

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)作為脊柱損傷后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,每年發(fā)病率約為20～40例/100萬人[1],其致殘率高、治愈率低,給患者身心帶來嚴(yán)重創(chuàng)傷。脊髓在遭受直接外力后,會(huì)出現(xiàn)不可逆的原發(fā)性損傷,在原發(fā)性損傷的幾秒鐘內(nèi),機(jī)體會(huì)啟動(dòng)一系列繼發(fā)性級聯(lián)反應(yīng),包括炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、自由基損傷等,從原發(fā)性損傷部位擴(kuò)散,造成脊髓的二次損傷,導(dǎo)致患者運(yùn)動(dòng)、排尿功能喪失[2]。前期研究發(fā)現(xiàn),芒針秩邊和水道穴可以減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,改善大鼠排尿功能[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過芒針深刺秩邊穴,觀察芒針干預(yù)后大鼠運(yùn)動(dòng)功能變化和炎癥因子含量的變化,探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級成年雄性 Wister大鼠 81只,體質(zhì)量(230±20)g,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司[動(dòng)物使用許可證號為 SCXK(滬)2017-0005],由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心分籠飼養(yǎng),每籠4只,溫度20～24℃,濕度50%～70%,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器

蘇木素-伊紅(上海依赫生物科技有限公司)、乙醇(杭州化學(xué)試劑有限公司)、二甲苯(廣州市振發(fā)貿(mào)易有限公司)、鹽酸(濟(jì)南坤豐化工有限公司)、氨水(杭州長征化工廠)、多聚甲醛(天津市化學(xué)試劑研究所)、酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(R&D,美國)、TaKaRa試劑盒(Invitrogen公司,美國)、Trizol試劑(Invitrogen公司,美國);0.30 mm×50 mm針灸針(江蘇佳辰牌),10 g克氏針(江蘇金鹿醫(yī)療器械公司,ZX105),恒溫箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),勻漿器(金偉實(shí)驗(yàn)儀器,江蘇),Bio-Tek ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Varioskan Flash),AP280-2包埋機(jī)(MICROM公司),HM335E切片機(jī)(MICROM公司),Nikon eclipse 80i顯微鏡(Nikon公司),Step one plus PCR儀(美國ABl)。

1.3 脊髓損傷模型的建立

應(yīng)用改良 Allen's造模法[5]制備大鼠脊髓損傷模型,實(shí)驗(yàn)順序隨機(jī)進(jìn)行。大鼠稱重后用 3%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg)[6]腹腔注射麻醉,待大鼠無四肢反應(yīng)后將其俯臥位于操作臺(tái)上,以第11肋為標(biāo)志找出T11棘突,沿背部正中由T11棘突向頭部方向作一長約2.5 cm的切口,鈍性分離椎旁肌肉,咬除 T9-10棘突及全部椎管,暴露 0.5 cm寬硬膜,用自制的改良打擊裝置(質(zhì)量為10 g的克氏針沿帶有刻度的透明管從60 mm高處垂直自由下落,致傷量為60 g/cm)造成脊髓中度損傷,使大鼠出現(xiàn)痙攣性擺動(dòng)、擺尾反射,致傷后迅速移開打擊物,逐層縫合切口,大鼠出現(xiàn)雙下肢遲緩性癱瘓,BBB評分小于2分,證明造模成功[7-8]。造模后每日2次人工膀胱按摩協(xié)助排尿。

1.4 大鼠分組及處理

選擇健康雄性Wister大鼠81只,隨機(jī)分為正常組9只、模型組36只和芒針組36只,分別于術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d行BBB評分,術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d取受損段脊髓行ELISA檢測、RT-qPCR檢測和HE染色。模型組大鼠正常飼養(yǎng)不作其他處理,芒針組大鼠于術(shù)后麻醉蘇醒后開始行雙側(cè)秩邊穴芒針治療,每日1次,每次30 min,治療前需人工按摩排空膀胱。

1.5 實(shí)驗(yàn)干預(yù)

參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]取穴標(biāo)準(zhǔn)確定大鼠秩邊穴,在臀外下部,股骨大轉(zhuǎn)子與薦椎尾椎結(jié)合部連線外1/3與中1/3交點(diǎn)處(圖1[10])。針刺前人工按摩排空膀胱,用長50 mm針灸針在大鼠秩邊穴直刺,輕捻緩進(jìn)達(dá)同側(cè)腹部皮下,深度2 cm左右(圖2),每5 min捻轉(zhuǎn)行針1次,30 min后出針。

圖1 大鼠秩邊穴示意圖

圖2 大鼠針刺圖

1.6 行為學(xué)觀察及運(yùn)動(dòng)功能評價(jià)

參照Basso DM等[11]BBB運(yùn)動(dòng)功能評分法,分別于術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d對大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評價(jià),評分范圍為0～21分。采用雙人雙盲獨(dú)立觀察,觀察者為非本組實(shí)驗(yàn)人員,但對評分標(biāo)準(zhǔn)熟悉。因大鼠晝夜活動(dòng)差別較大,評分均于晚上 7點(diǎn)進(jìn)行,觀察期為2 min,每只測3次,取其平均值,最后結(jié)果為兩位觀察者的平均記錄分?jǐn)?shù)。評價(jià)前檢查所有動(dòng)物膀胱是否充盈,以免因膀胱充盈而影響活動(dòng)。

1.7 脊髓組織取材

將正常組大鼠及1 d、3 d、5 d、7 d的模型組和芒針組大鼠隨機(jī)取6只,腹腔注射過量戊巴比妥鈉,待動(dòng)物麻醉后于冰上迅速剪取長約1 cm受損段脊髓組織存入-80℃冰箱,用于ELISA檢測和RT-qPCR檢測;每組另取3只大鼠,戊巴比妥鈉深度麻醉,生理鹽水心臟灌注后迅速取損傷段脊髓,4%多聚甲醛固定,乙醇梯度脫水,透明后浸臘包埋,連續(xù)切片,片厚4 μm,用于蘇木素-伊紅染色。

1.8 指標(biāo)檢測

1.8.1 ELISA檢測

按照大鼠 HMGB1、NF-κB、IL-6酶聯(lián)免疫檢測試劑盒使用說明書進(jìn)行操作,采用生物素雙抗夾心技術(shù)檢測脊髓組織中 HMGB1、NF-κB、IL-6水平。簡要實(shí)驗(yàn)步驟為準(zhǔn)備試劑(生物素標(biāo)記的抗 HMGB1抗體、抗NF-κB抗體、抗IL-6抗體、鏈霉親和素-HRP),將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋;加入準(zhǔn)備好的樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記二抗和酶標(biāo)試劑,37℃反應(yīng)1 h;洗板5次,加入顯色液A、B,37℃避光顯色 10 min;加入終止液終止反應(yīng);10 min內(nèi)讀取各孔的吸光度(OD值)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液的檢測結(jié)果得出標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出各組樣品的實(shí)際濃度。

1.8.2 HE染色

將切片置60℃烤箱烘烤2 h,二甲苯、乙醇梯度脫水后蘇木素初染5 min,流水沖洗2 min,0.5%鹽酸乙醇分化5 s,流水沖洗1 min,0.5%稀氨水返藍(lán)20 s,流水沖洗3 min,0.5%伊紅染液染色2 min,流水沖洗1 min,80%和 95%乙醇依次脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,Nikon DS-Fi1 500萬象素 CCD相機(jī)(Nikon,Tokyo,apan)攝片。

1.8.3 RT-qPCR檢測

采用Trizol法分組提取總RNA,檢測RNA濃度及純度。按照TaKaRa試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),以待檢測基因的引物為模板(引物序列見表1),采用Step one plus PCR儀(美國 ABl)進(jìn)行熒光定量 PCR檢測,以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行相對定量分析。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用重復(fù)測量方差分析檢驗(yàn)主效應(yīng)、時(shí)間效應(yīng)和交互效應(yīng),組間差異采用單因素方差分析,兩兩比較應(yīng)用LSD法(方差齊)或Tunnett T3法(方差不齊)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察和BBB評分

脊髓損傷后,模型組和芒針組大鼠的 BBB評分明顯低于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);芒針治療后,芒針組大鼠的BBB評分高于模型組,在5 d和7 d時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),說明芒針的治療效果與治療療程之間存在時(shí)間效應(yīng)(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠BBB運(yùn)動(dòng)功能評分比較 (,分)

表2 各組大鼠BBB運(yùn)動(dòng)功能評分比較 (,分)

注:與正常組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

模型組 9 1.00±0.661) 1.80±0.911) 2.20±0.631) 3.20±0.631)芒針組 9 1.30±0.671) 2.40±0.841) 4.60±0.961)2) 7.40±1.071)2)正常組 9 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00

2.2 脊髓組織中HMGB1、NF-κB及IL-6水平比較

為了測試芒針治療是否可抑制 HMGB1、NF-κB、IL-6等相關(guān)炎性因子的表達(dá),分析了損傷節(jié)段脊髓組織中HMGB1、NF-κB、IL-6水平及HMGB1mRNA、NF-κBmRNA、IL-6mRNA水平。脊髓損傷后,模型組和芒針組大鼠脊髓組織中 HMGB1、NF-κB、IL-6水平及 HMGB1mRNA、NF-κBmRNA、IL-6mRNA水平較正常組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);芒針治療后,芒針組大鼠脊髓組織中HMGB1、NF-κB、IL-6水平及HMGB1mRNA、NF-κBmRNA、IL-6mRNA水平較模型組下降,在3 d、5 d和7 d時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),說明芒針治療對炎癥因子的表達(dá)具有明顯的抑制作用。詳見表3-8。

表3 各組大鼠脊髓組織中HMGB1水平比較 (,ng/mL)

表3 各組大鼠脊髓組織中HMGB1水平比較 (,ng/mL)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

模型組 6 1.902±0.1161) 1.940±0.0981) 1.933±0.1021) 1.931±0.0971)芒針組 6 1.796±0.0681) 1.706±0.0581)2) 1.637±0.0681)2) 1.591±0.0551)2)正常組 6 1.316±0.011 1.316±0.011 1.316±0.011 1.316±0.011

表4 各組大鼠脊髓組織中NF-κB水平比較 (,pg/mL)

表4 各組大鼠脊髓組織中NF-κB水平比較 (,pg/mL)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后5 d 術(shù)后7 d模型組 6 2229.16±141.281) 2295.42±98.361) 2244.07±107.111) 2223.36±200.441)芒針組 6 2056.73±157.741) 1770.72±100.281)2) 1639.63±131.401)2) 1564.06±173.121)2)正常組 6 1346.10±131.50 1346.10±131.50 1346.10±131.50 1346.10±131.50

表5 各組大鼠脊髓組織中IL-6水平比較 (,pg/mL)

表5 各組大鼠脊髓組織中IL-6水平比較 (,pg/mL)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

模型組 6 289.89±18.391) 303.55±20.591) 292.21±16.021) 282.94±24.151)芒針組 6 281.05±15.091) 244.24±17.531)2) 193.66±18.361)2) 179.29±22.441)2)正常組 6 109.87±9.37 109.87±9.37 109.87±9.37 109.87±9.37

表6 各組大鼠脊髓組織中HMGB1mRNA水平比較 ()

表6 各組大鼠脊髓組織中HMGB1mRNA水平比較 ()

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后5 d 術(shù)后7 d模型組 6 0.000907±0.0000331) 0.001263±0.0000601) 0.001123±0.0000401) 0.000992±0.0000441)芒針組 6 0.000911±0.0000321) 0.000885±0.0000211)2) 0.000858±0.0000211)2) 0.000799±0.0000281)2)正常組 6 0.000627±0.000028 0.000627±0.000028 0.000627±0.000028 0.000627±0.000028

表7 各組大鼠脊髓組織中NF-κBmRNA水平比較 ()

表7 各組大鼠脊髓組織中NF-κBmRNA水平比較 ()

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后5 d 術(shù)后7 d模型組 6 0.001498±0.0000301) 0.001663±0.0000441) 0.001593±0.0000471) 0.001500±0.0000381)芒針組 6 0.001275±0.0000361) 0.001208±0.0000301)2) 0.001130±0.0000441)2) 0.000992±0.0000311)2)正常組 6 0.000759±0.000026 0.000759±0.000026 0.000759±0.000026 0.000759±0.000026

表8 各組大鼠脊髓組織中IL-6mRNA水平比較 ()

表8 各組大鼠脊髓組織中IL-6mRNA水平比較 ()

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后5 d 術(shù)后7 d模型組 6 0.001697±0.0000611) 0.001799±0.0000421) 0.001680±0.0000791) 0.001486±0.0000271)芒針組 6 0.001541±0.0000381) 0.001453±0.0000521)2) 0.001370±0.0000391)2) 0.001323±0.0000411)2)正常組 6 0.000934±0.000059 0.000934±0.000059 0.000934±0.000059 0.000934±0.000059

2.3 脊髓組織的HE染色

正常組脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)結(jié)構(gòu)正常,神經(jīng)細(xì)胞呈正常的組織結(jié)構(gòu),神經(jīng)元細(xì)胞類圓形,胞漿豐富,邊界清晰,周圍有較多的中小型神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞;模型組脊髓組織松散,灰質(zhì)中有許多空洞形成,伴有炎性細(xì)胞浸潤,神經(jīng)元細(xì)胞固縮;芒針組在損傷初期,脊髓構(gòu)造欠清晰,損傷部位的空洞明顯,殘留的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不清,隨著治療周期延長,損傷部位的空洞及炎性細(xì)胞逐漸減少,神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)好轉(zhuǎn)。詳見圖3。

3 討論

眾所周知,炎癥反應(yīng)是脊髓損傷后繼發(fā)性損害的主要機(jī)制之一。脊髓損傷后的炎癥浸潤,會(huì)擴(kuò)大脊髓壞死和凋亡的實(shí)際部位,加劇脊髓組織變性,抑制脊髓功能恢復(fù)[12]。大量臨床研究發(fā)現(xiàn),許多疾病的發(fā)生、發(fā)展均與HMGB1參與的炎癥反應(yīng)相關(guān)[13-14]。HMGB1作為一種重要的促炎介質(zhì),其表達(dá)的增加可能直接導(dǎo)致下游炎癥因子表達(dá)的上調(diào)[15];IL-6主要是由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌,刺激免疫反應(yīng),是引起炎癥反應(yīng)的重要促炎因子[16-17],當(dāng)它與HMGB1結(jié)合后可增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的活性;NF-κB是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)重要的轉(zhuǎn)錄因子,其參與調(diào)節(jié)許多炎癥的基因和信號通路[18],而其介導(dǎo)的信號通路可調(diào)控相關(guān)促炎因子的表達(dá)[15]。通過實(shí)驗(yàn)證明了脊髓損傷后 HMGB1、NF-κB和 IL-6呈高表達(dá),芒針治療一段時(shí)間后,HMGB1、NF-κB和IL-6表達(dá)明顯降低,而未予任何治療的模型組,HMGB1、NF-κB和IL-6仍處于高表達(dá)狀態(tài)。從而推測,芒針的抗炎機(jī)制可能包括抑制HMGB1的表達(dá),降低NF-κB信號通路的傳導(dǎo),下調(diào)促炎因子IL-6的分泌。

針灸作為中醫(yī)學(xué)的瑰寶,具有抗炎、抗凋亡、鎮(zhèn)痛等作用[19],芒針作為一種特制的長針,因形狀細(xì)長如麥芒,故稱芒針。《靈樞·九針論》記載:“八曰長針,取法于綦針,長七寸,主取深邪遠(yuǎn)痹者也。”芒針的針刺特點(diǎn)是深刺透穴,其取穴精簡,針感強(qiáng),通過穴位、經(jīng)絡(luò)和神經(jīng)體液起到加強(qiáng)表里經(jīng)、鄰近經(jīng)的經(jīng)氣流通,特別適合癱瘓、軟組織疼痛等疾病的治療[20]。本研究結(jié)果顯示,芒針治療后大鼠的BBB評分比未治療大鼠高,隨著治療周期的延長,兩組評分差異加大,說明芒針治療對脊髓損傷后大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)有促進(jìn)作用。

根據(jù)中醫(yī)學(xué)氣血經(jīng)絡(luò)理論,脊髓所過之處可受督脈、膀胱經(jīng)及華佗夾脊的經(jīng)氣濡養(yǎng),許多研究選用損傷段局部的夾脊穴針刺,直達(dá)病所,促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能的重建[21-22]。因本實(shí)驗(yàn)脊髓損傷模型大鼠椎板被咬除,針刺夾脊穴或者督脈穴位,易刺傷脊髓,故未采用損傷局部的夾脊穴作研究。而且,課題組大量研究發(fā)現(xiàn)秩邊穴透刺,也可促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)[23]。秩邊穴[24]屬足太陽膀胱經(jīng)穴,位于第21椎下旁開3寸,與骶管裂孔相平,深層正對坐骨大孔,有臀下血管、臀下神經(jīng)、股后皮神經(jīng)、陰部神經(jīng)及坐骨神經(jīng)通過,是芒針重用穴之一,對秩邊穴行不同方向和深度的針刺,伴隨針感傳導(dǎo)部位的不同,所治之癥也各異,既可治療小便不利,又可治療下肢痿痹[25],《中華特針臨床發(fā)揮》一書中就有秩邊穴直刺治療下肢痿證的記載。筆者通過臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn),當(dāng)秩邊穴深刺至坐骨大切跡后上方髂翼外面的骨面,酸脹感可向同側(cè)下肢放射至小腿或足踝部,產(chǎn)生與透刺相當(dāng)?shù)尼樃?這樣也可避免透刺過程中因操作人員解剖不熟練而造成局部的神經(jīng)損傷。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠秩邊穴深刺,針尖直抵同側(cè)腹部皮下,進(jìn)針深度 2 cm左右,手下有沉緊感為得氣。

據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載,脊髓損傷應(yīng)按“體墮”和“痿證”進(jìn)行辨證論治,“體墮”指的是急性脊髓損傷,而“痿證”多指慢性脊髓損傷或急性脊髓損傷后期。中醫(yī)學(xué)在治療“痿證”上療效確切,臨床報(bào)道并不少見,但關(guān)于“體墮”治療的報(bào)道卻不多,曾有人提出在急性脊髓損傷術(shù)后立即配合針灸、中藥治療,可有效降低脊髓損傷的并發(fā)癥,而且,針灸干預(yù)越早,患者神經(jīng)功能恢復(fù)的情況越好[26]。本研究通過人為條件造成大鼠急性脊髓損傷模型,通過檢測發(fā)現(xiàn)損傷段脊髓組織中的HMGB1、NF-κB及IL-6大量聚集,HMGB1作為一種重要的促炎癥反應(yīng)的DNA結(jié)合蛋白[27-28],可能是脊髓損傷后炎癥信號的觸發(fā)器[29],可導(dǎo)致促炎因子 IL-6的釋放,當(dāng)IL-6與HMGB1結(jié)合后又可增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的活性;同時(shí),脊髓損傷后NF-κB的大量表達(dá),也可調(diào)控促炎因子IL-6的表達(dá)。所以,三者之間相互作用,介導(dǎo)了脊髓損傷后的炎癥級聯(lián)反應(yīng)[30]。因此推測,作為促炎介質(zhì)的HMGB1可能協(xié)同相關(guān)炎癥因子參與脊髓損傷后的炎癥反應(yīng),加劇脊髓損傷,影響大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù),但其具體調(diào)控通路尚不清楚,這也是本課題組下一步的研究方向。另外,觀察各時(shí)間點(diǎn)大鼠的BBB評分發(fā)現(xiàn),同一時(shí)間點(diǎn),芒針治療組大鼠的運(yùn)動(dòng)評分較模型組高,脊髓組織中的炎性因子表達(dá)較模型組明顯減少,表明芒針對脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)有一定抑制作用,其抗炎機(jī)制可能包括抑制HMGB1的表達(dá),降低 NF-κB信號通路的傳導(dǎo),下調(diào)促炎因子IL-6的分泌。芒針作為中醫(yī)學(xué)中一種特殊的療法,從治療的指導(dǎo)思想到選穴配方,都有其獨(dú)特之處,有望在神經(jīng)系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、精神系統(tǒng)等多學(xué)科中發(fā)揮其優(yōu)勢。