張運峰，馬超穎，胡 芬，陳 超

（1. 唐山師范學院 生命科學系，河北 唐山 063000；2. 華北理工大學 生命科學學院，河北 唐山 063210）

細胞骨架由微管、微絲以及中間絲組成，是真核細胞的重要結構組分，參與了細胞內物質運輸、細胞器的定位和細胞分裂等許多重要的細胞生命活動。細胞骨架的發(fā)現在細胞生物學發(fā)展歷程上具有里程碑式的意義[1]，早已成為生命科學研究的熱點。細胞骨架的觀察實驗是細胞生物學本科實驗教學中開出率最高的項目之一[2]，可以幫助學生深刻理解細胞活動的復雜性，還可以提高他們深入探索細胞奧秘的興趣[2]。傳統(tǒng)的本科細胞骨架教學實驗一般是以洋蔥表皮細胞為實驗材料，采用考馬斯亮藍對細胞骨架染色后用普通的光學顯微鏡觀察。由于考馬斯亮藍染料能對所有的蛋白著色，并不具有針對細胞骨架染色的特異性[3-4]，因此導致學生實驗中難以分辨清楚洋蔥內表皮細胞中的微絲結構。

免疫熒光試驗是用特異性抗體與標本中相應抗原反應后，再用熒光素標記的第二抗體（抗抗體）與之結合，然后在熒光顯微鏡下觀察實驗結果。該法具有特異性強、可操作性和重復性好、結果穩(wěn)定、受環(huán)境因素影響小等優(yōu)點，在科研中被廣泛應用[5]。我們嘗試將這一技術引入到骨架細胞觀察實驗教學中，取得了較好教學效果

1 材料

1.1 細胞株

Hela 細胞，培養(yǎng)條件：37 ℃、5%CO2；1640培養(yǎng)基，含10%小牛血清及1%雙抗。

1.2 主要試劑和儀器

細胞固定液、PBS 緩沖液、TritonX-100、抗熒光淬滅封片劑，均購自索萊寶生物技術公司；鼠抗人的單克隆抗體和FITC 標記的羊抗鼠的熒光二抗，均購自Sigma 公司。

細胞成像系統(tǒng)（Thermofisher，EVOS FL），二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermofisher，4111）。

2 方法

2.1 細胞的培養(yǎng)

實驗前一天，選擇生長狀態(tài)良好的Hela 細胞，經過胰酶消化、細胞計數板計數和全培養(yǎng)基稀釋，獲得1×104/ml 的細胞懸液。按照200 μL/孔的標準，接種細胞于48 孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。

2.2 細胞的固定、通透和封閉

（1）洗滌：取出細胞，用500 μL/孔的PBS緩沖液洗滌2 次，每次10 min。

（2）固定：200 μL/孔的多聚甲醛進行細胞固定，室溫靜置20 min。

（3）通透：0.3%PBS-TritonX-100 200 μL/孔，室溫靜置5 min。

（4）洗滌：去掉PBS-TritonX-100 處理液，500 μL/孔PBS 緩沖液洗滌2 次，每次10 min。

（5）封閉：吸去PBS 緩沖液，加入100 μL/孔1%PBS-BSA 封閉液，37 ℃，30 min。

2.3 抗體的標記和DAPI 染色

將封閉液去掉，滴加100 μL 一抗稀釋液，37 ℃孵育30 min，用PBS 緩沖液洗滌3 次，每次3 min；滴加100 μL FITC 標記熒光二抗，37 ℃孵育20 min，PBS 洗滌1 次，5 min；滴加100 μL的抗熒光淬滅劑。

2.4 細胞的熒光觀察

使用屏幕式倒置熒光顯微鏡觀察細胞骨架。

3 影響實驗效果的因素分析

免疫熒光技術應用到細胞骨架觀察實驗教學中，是一種新的嘗試。經過大量實驗，發(fā)現實驗材料的選取、細胞融合度的選擇、細胞爬片的選擇、觀察裝置的選擇、教學組織形式的選擇等因素對實驗教學效果影響較大。

3.1 實驗材料的選取

選取生長較快、易于培養(yǎng)的細胞系，實驗成功率更高。

3.2 細胞融合度的選擇

細胞的密度控制在50%～80%，能取得最佳效果，過高的融合度會形成很強的干擾效應，降低熒光成像清晰度。

3.3 細胞爬片的選擇

實驗沒有采用傳統(tǒng)的細胞爬片[6,7]，而是改進為48 孔板接種，這不僅簡化了實驗準備步驟，降低實驗過程的難度，利于學生的操作，同時也增強了指導教師對學生的操作過程掌控，保證了教學的效果。

3.4 觀察裝置的選擇

選擇屏幕式倒置顯微鏡或者帶顯微照相系統(tǒng)的熒光顯微鏡進行觀察，實時呈現并記錄保存實驗結果。圖像的即時呈現有利于學生初步了解和分析實驗結果，及時保則便于多組間的結果比較，并減少熒光淬滅現象對實驗結果細節(jié)的影響。

3.5 教學組織形式的選擇

熒光顯微鏡數量是免疫熒光實驗教學效果的一個制約因素。采用分組實驗的模式，通過優(yōu)化實驗步驟，使分組數量和小組各步驟間隔時間相適應；再通過合理延長個別步驟的時間，可以使各組按序進行，避免不同組重疊交叉，保證教學組織有序、迅捷。

4 結果與討論

FITC 標記的細胞骨架經藍光激發(fā)后，綠色熒光覆蓋了整個細胞，絲狀骨架結構明顯（圖1）。在細胞的中心位置有一個熒光強度較弱的近圓形區(qū)域暗區(qū)，推測其為細胞核；熒光由其向四周延展，充滿整個細胞，且越靠近該區(qū)域，熒光的強度越強，骨架纖維越明顯。實驗的熒光圖像結果與細胞骨架在細胞中實際分布高度一致，確定了本實驗的準確性。當學生熟悉這一技術的操作后，可以讓學生探索溫度、抗體結合時間、抗體濃度等因素對實驗結果的影響。有條件的實驗室也可開展用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽染色觀察微絲、采用多色免疫熒光分別標記不同細胞骨架，使實驗結果更豐富、有趣。

圖1 Hela 細胞骨架的間接免疫熒光觀察