鄭 宇 馬 銳 遲放魯 △ 趙 萌

（1復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科研究院，2耳鼻喉科，5實驗中心 上海 200031；3上海市聽覺醫(yī)學臨床中心 上海 200031；4國家衛(wèi)生健康委員會聽覺醫(yī)學重點實驗室 上海 200031）

與低等脊椎動物不同，哺乳動物的耳蝸毛細胞在受損以后無法自發(fā)性的再生，這正是導致哺乳動物出現(xiàn)永久性感音神經(jīng)性聾的關鍵原因之一。目前認為，通過生物學方式促進耳蝸毛細胞損傷或者缺失之后的功能性再生是實現(xiàn)聽覺功能重建的理想方式。

Atoh1，又名math1，在1999年首次被確認是決定毛細胞命運的關鍵轉(zhuǎn)錄因子［1］。Atoh1敲除后，小鼠的內(nèi)耳毛細胞完全缺失，并且耳蝸毛細胞周圍的支持細胞也完全缺失［1-4］。隨后相關實驗表明，通過質(zhì)粒或者腺病毒等作為載體的Atoh1過表達可以誘導耳蝸感覺上皮和非感覺上皮的毛細胞再生［5-10］。Pan等［11］通過構建小鼠的“Atoh1表達自我終止”模型表明，Atoh1表達的減少或者自我終止，可以導致在出生后3周內(nèi)幾乎所有的內(nèi)毛細胞和大部分外毛細胞逐漸喪失，盡管有部分殘余毛細胞表達毛細胞標記物myo7a，但這些殘余的毛細胞并未分化出正常的纖毛束。另一項研究表明在胚胎發(fā)育的第15.5天（E15.5）敲除Atoh1可以導致所有毛細胞的死亡，相比之下，在胚胎發(fā)育的第16.5天敲除Atoh1只能導致耳蝸頂圈的毛細胞死亡，但是整個耳蝸毛細胞的表面纖毛形態(tài)異常［12］。這些研究表明，毛細胞的生存、分化乃至表面纖毛的發(fā)育形態(tài)都與Atoh1的表達水平及持續(xù)時間相關。

Prestin于2000年首次被確定為耳蝸外毛細胞的運動蛋白，僅在耳蝸的外毛細胞中表達，具有獨特的微秒級的機電直接轉(zhuǎn)換能力，它是外毛細胞在收到電刺激時將膜電位的變化轉(zhuǎn)換為胞體的伸縮運動的蛋白分子基礎［13-14］。基于馬達蛋白prestin的外毛細胞運動對于哺乳動物正常的聽覺靈敏度和頻率選擇性至關重要。據(jù)報道，由外毛細胞運動引起的耳蝸放大可使聽覺提高40～50 dB［15］?？傊琾restin不僅僅是外毛細胞的終末分化標志蛋白之一，更是其充分發(fā)揮功能的關鍵和基礎。因此，能否再生出可以表達prestin的毛細胞樣細胞是毛細胞再生領域關鍵的一步。就目前而言，在小上皮嵴區(qū)域再生出的異位毛細胞樣細胞能否表達prestin蛋白尚不清楚。

本實驗主要探究Atoh1過表達水平對耳蝸小上皮嵴區(qū)域毛細胞樣細胞數(shù)量、prestin表達情況及其表面纖毛形態(tài)的影響。報告如下。

材料和方法

耳蝸取材及培養(yǎng)將新生第1天（P1）的SD大鼠（上海杰斯捷公司）用CO2麻醉處死，75%乙醇頭部消毒后，取出耳蝸組織，解剖方法已有詳述［7］，之后去除頂回最尖端的1/2圈，去除鉤回，將余下的2.5圈分為3段，從頂?shù)降滓来螢轫敹?、中段、底段，其中僅取中段基底膜移入培養(yǎng)皿，并按照其原來的弧度，貼在已被多聚賴氨酸包被的小圓玻片上，加入5%FBS培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)（37℃，5%的CO2）24 h后的耳蝸中圈組織的體外培養(yǎng)情況見圖1B。

腺病毒感染腺病毒由賽諾公司（中國）合成，含報告基因EGFP（增強的綠色熒光蛋白），實驗組使用的腺病毒為Ad5-EGFP-Atoh1，EGFP作為Atoh1的上游基因，其表達的綠色熒光蛋白信號強度可以間接反映Atoh1的過表達水平。對照組轉(zhuǎn)染用的腺病毒為Ad5-EGFP（簡稱G）。我們先將原先的5%FBS培養(yǎng)液全部更換為B27培養(yǎng)液，并加入Ad5-EGFP-Atoh1（簡稱GA），使其工作濃度為0.1×108和0.4×108PFU/mL，部分實驗增加一組0.2×108PFU/mL，對照組加入 0.4×108PFU/mL的 Ad5-EGFP。放入培養(yǎng)箱中孵育16～20 h，之后全量更換為新鮮的B27培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以加入病毒的時間點開始計時，加入病毒后的第24 h稱為DVI 1，以此類推，依次為 DVI 2，DVI 3......。

免疫熒光染色培養(yǎng)組織取出后用4%的多聚甲醛（美國Sigma-Aldrich公司）室溫固定2 h，0.1%Triton X-100（溶于PBS）通透30 min后，用10%驢血清封閉液（溶于0.1%Triton X-100，美國Merkmilli Pore公司）室溫孵育1 h，然后加一抗4°C冰箱過夜，第二天用0.1%Triton X-100的1×PBS（PBST）漂洗標本3次及以上，每次至少2 h，加二抗，室溫孵育2 h，漂洗標本，封片。本實驗中用到的一抗：Myosin VIIa（鼠來源抗體，1∶200，美國 Proteus Biosciences 公司），prestin（兔來源抗體，1∶200，美國 Santa Cruz公司）。二抗：驢抗鼠-Cy5（1∶1 000）和驢抗兔—Rho（1∶1 000），均來源于美國Jackson免疫研究實驗室。共聚焦掃描顯微鏡（Leica-SP8）用于免疫熒光染色標本的掃描。其中培養(yǎng)組織塊免疫熒光染色無需切片，每個時間點每個濃度下對照組取半只到1只SD新生大鼠（即1～2個耳蝸中圈組織）用于免疫熒光染色，而實驗組則至少取3只SD新生大鼠（即6個耳蝸中圈組織）用于免疫染色及后續(xù)的計數(shù)統(tǒng)計。

RNA的提取和qRT-PCR每個時間點每個濃度取12個體外培養(yǎng)組織（即6只SD新生大鼠）進行RNA的純化提取，之后擬轉(zhuǎn)錄合成DNA，具體步驟已有詳述［16］，PCR 引物設計（5'-3'）如下：GAPDH，AGT GCC AGC CTC GTC TCA TA（Forward）；TGA ACT TGC CGT GGG TAG AG（Reverse）；Atoh1，TCATCGTCCCATAGTCCGTG（Forward）；TCC CTT ACG AGT GAG TGA GC（Reverse）。

掃描電鏡取不同濃度下培養(yǎng)后第9天的樣本（實驗組每個濃度下取2只SD新生大鼠，而對照組只取1只）用PBS沖洗3次，2.5%戊二醛（使用0.1 mol/L PB配制）固定標本，4℃冰箱過夜。之后0.1 mol/L PB漂洗10 min×3次；2%單寧酸常溫孵育30 min；0.1 mol/L PB漂洗10 min×3次；1%鋨酸固定液，室溫 2 h，0.1 mol/L PB 漂洗 10 min×3次，30%、50%、60%、70%乙醇脫水各15 min，70%乙醇4℃過夜，之后80%、90%乙醇脫水各15 min，最后用100%的乙醇（無水乙酸鈉處理）脫水2次，每次15 min。臨界點干燥，噴金。掃描電鏡Topcon DS-130F行樣本掃描，電壓10 kV。

統(tǒng)計學分析隨機選取長度為200 μm且平行于耳蝸長軸的小上皮嵴區(qū)域進行觀察，每組（每個時間點下的每一個濃度）至少選取5段中圈耳蝸，每段基底膜選取10處進行計數(shù)，選取Myosin7a/EGFP雙陽性細胞作為異位毛細胞樣細胞。使用SPSS 22軟件對數(shù)據(jù)進行處理，本實驗的計數(shù)統(tǒng)計比較采用的t檢驗，若t檢驗不滿足，則使用ranksum秩和檢驗，比例的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。Graphpad Prism7繪制柱狀圖。

結(jié) 果

帶有Atoh1基因的腺病毒轉(zhuǎn)染濃度與培養(yǎng)組織的Atoh1 mRNA表達水平成正相關在腺病毒轉(zhuǎn)染后第3天，qRT-PCR結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染了帶有Atoh1基因的腺病毒（實驗組）中，0.4×108PFU/mL組體外培養(yǎng)組織Atoh1的mRNA表達水平要明顯高于0.1×108PFU/mL組（P＜0.01）。此外，實驗組中0.1×108PFU/mL組的Atoh1 mRNA表達水平亦要高于對照組（P＜0.01）。在腺病毒轉(zhuǎn)染第5天和第7天，實驗組中0.4×108PFU/mL組的Atoh1 mRNA表達水平均明顯高于0.1×108PFU/mL組（P＜0.01，P＜0.05），結(jié)果提示通過提高帶有Atoh1基因的腺病毒濃度，可以提高培養(yǎng)組織的Atoh1 mRNA表達水平（圖1A）。另外在實驗組中，病毒濃度的越高，小上皮嵴區(qū)的綠色熒光蛋白信號越強，提示Atoh1的過表達水平越高（圖2 E、F、G）。

Atoh1過表達水平對能夠表達prestin的異位毛細胞樣細胞數(shù)量的影響實驗組所采用的轉(zhuǎn)染濃度即 0.1×108PFU/mL、0.2×108PFU/mL、0.4×108PFU/mL均能在小上皮嵴再生出異位毛細胞樣細胞，在病毒轉(zhuǎn)染后第 5天（DVI5）、第7天（DVI7）及第9天（DVI9）實驗組的腺病毒濃度越高，再生的異位毛細胞樣細胞（myo7a陽性）數(shù)量越多（圖3，5 d：4.50±1.66vs.12.55±3.51，26.35±4.96；7 d：8.50+1.24vs.22.05±1.91，36.57±10.19；9 d：18.59±5.77vs.41.36±13.75，60.19+14.70），而對照組小上皮嵴無異位毛細胞樣細胞出現(xiàn)。此外無論是實驗組還是對照組，體外培養(yǎng)下的原位外毛細胞的prestin均于病毒轉(zhuǎn)染后第7天開始出現(xiàn)表達（圖2）。

在實驗組中，不同病毒轉(zhuǎn)染條件下，異位毛細胞樣細胞也均在病毒轉(zhuǎn)染后第7天開始表達prestin。在病毒轉(zhuǎn)染后第9天，實驗組中腺病毒濃度越高，異位毛細胞樣細胞中能夠表達prestin的細胞數(shù)量也越多，差異具有統(tǒng)計學意義（圖4，9 d：1.50+1.41vs.3.82±3.47，5.43±2.54），但是小上皮嵴區(qū)域所有新生毛細胞中能夠表達prestin的新生毛細胞所占的比例，在不同濃度組差異無統(tǒng)計學意義（圖5，9 d：8.77%±8.28%vs.8.50%±6.43%，9.76%±5.29%）。

Atoh1過表達水平影響異位毛細胞樣細胞表面纖毛形態(tài)對照組腺病毒（不含Atoh1基因）轉(zhuǎn)染后第9天，體外培養(yǎng)組織的小上皮嵴區(qū)域呈扁平狀，細胞表面輪廓為多邊形，無纖毛出現(xiàn)（圖6A），其原位區(qū)域毛細胞的表面纖毛基本正常。在實驗組腺病毒（含Atoh1基因）低濃度轉(zhuǎn)染后第9天，體外培養(yǎng)組織的小上皮嵴區(qū)域出現(xiàn)不規(guī)則的纖毛，突出于細胞表面（圖6B）。在實驗組腺病毒（含Atoh1基因）高濃度轉(zhuǎn)染后第9天，體外培養(yǎng)組織的小上皮嵴區(qū)域出現(xiàn)形態(tài)較為規(guī)則的纖毛，靜纖毛長度從低到高排列，纖毛間可以見側(cè)連接和頂連接（圖6C）

討 論

自Atoh1在1999年被確認是決定毛細胞命運的關鍵因子之后，許多研究者以Atoh1為目的基因，研究其在毛細胞發(fā)育和再生中的作用［8-10，17-19］。目前已經(jīng)證實，以腺病毒為載體介導的Atoh1過表達可在體內(nèi)和體外實驗中誘導異位毛細胞樣細胞的形成［5-6，8-10，19］。本實驗同樣以腺病毒為載體，通過腺病毒攜帶Atoh1基因來轉(zhuǎn)染出生后第1天（P1）的SD大鼠的耳蝸基底膜中圈體外培養(yǎng)組織。在2012年，Pan等［11］通過構建“Atoh1表達自我終止”的體內(nèi)模型來研究Atoh1表達水平及作用時間對毛細胞發(fā)育的影響。該模型通過在Atoh1基因兩端插入loxp位點，在Atoh1基因表達以后，激活Atoh1的cre重組酶，從而達到Atoh1基因自我敲除的目的。本實驗則采用不同濃度的腺病毒分別進行轉(zhuǎn)染，并證實了通過提高帶有Atoh1基因的腺病毒濃度，可以提高培養(yǎng)組織小上皮嵴區(qū)域Atoh1 mRNA的表達水平。此外，我們還發(fā)現(xiàn)實驗組的病毒濃度越高，小上皮嵴區(qū)的綠色熒光蛋白信號越強，由于報告基因EGFP位于Atoh1基因的下游，其表達水平可間接反映Atoh1的過表達水平，因此該結(jié)果可提示病毒濃度的越高，Atoh1的過表達水平越高。

圖2 不同Atoh1過表達水平下原位毛細胞和異位毛細胞樣細胞的prestin表達情況Fig 2 Expression of prestin in hair cells and ectopic hair-cell-like cells under different Atoh1 over-expression level

通過調(diào)控腺病毒的濃度來引導Atoh1在小上皮嵴區(qū)域不同水平的過表達，我們發(fā)現(xiàn)病毒濃度越高，隨著培養(yǎng)時間的延長，小上皮嵴區(qū)域的異位毛細胞樣細胞數(shù)量越多，這一結(jié)果與之前的一項研究相吻合［5］。此外，在實驗組的3個濃度下，異位毛細胞樣細胞均于病毒轉(zhuǎn)染后第7天開始表達prestin，在病毒轉(zhuǎn)染后第9天，表達prestin的異位毛細胞樣細胞數(shù)量顯著增多，并且病毒濃度越高，表達prestin的異位毛細胞樣細胞數(shù)量越多，差異具有統(tǒng)計學意義。但是實驗組在3個不同濃度的條件下，能夠表達prestin的異位毛細胞樣細胞的比例卻并無統(tǒng)計學差異。因此，Atoh1過表達水平與誘導生成的prestin+異位耳蝸毛細胞樣細胞絕對數(shù)量正相關，其相關性很大程度上可能來源于myosin7a陽性細胞絕對數(shù)量的增加，而非Atoh1本身過表達的增加導致prestin表達的提高。雖然目前已經(jīng)確定Atoh1是耳蝸毛細胞分化的必要基因，但對于耳蝸毛細胞是如何進一步分化成內(nèi)毛細胞和外毛細胞，或者說是否還有其他因子導致了耳蝸毛細胞的進一步分化目前尚不明朗?？紤]到原位的外毛細胞全部都能表達prestin，而本研究中能夠表達prestin的異位毛細胞樣細胞的比例較低，因此我們推測除了Atoh1以外可能還有其他下游基因參與，促進毛細胞前體細胞向外毛細胞分化。

圖3 不同Atoh1過表達水平誘導的異位毛細胞樣細胞數(shù)量比較Fig 3 Comparison of the number of ectopic hair-cell-like cells induced by different Atoh1 over-expression level

圖4 不同Atoh1過表達水平誘導能夠表達prestin的異位毛細胞樣細胞數(shù)量比較Fig 4 Comparison of the number of ectopic hair-cell-like cells induced by different Atoh1 over-expression level that expressed prestin

之前曾有極個別的研究者在原位區(qū)域再生出了能夠表達prestin的新生毛細胞，但是在小上皮區(qū)域目前尚無人證實新生的毛細胞能夠表達prestin。因此，本實驗首次證實在小上皮嵴區(qū)域能夠再生出表達prestin的新生毛細胞，并研究了其與Atoh1過表達水平的關系。

除了研究異位毛細胞樣細胞在小上皮嵴是否能夠表達prestin外，我們還發(fā)現(xiàn)無論是對照組還是實驗組，P1SD大鼠中圈的基底膜原位區(qū)域外毛細胞的prestin表達均于病毒轉(zhuǎn)染后第7天開始?？紤]到組織培養(yǎng)的孵育時間，SD大鼠基底膜中圈的外毛細胞相當于在體內(nèi)的第8天（p8）開始表達prestin。Hang等［20］曾經(jīng)研究過體內(nèi) SD 大鼠的 prestin表達情況，發(fā)現(xiàn)SD大鼠底圈、中圈、頂圈的外毛細胞分別于第6天、第7天和第9天開始表達prestin。我們的結(jié)果與其相差了僅僅一天，其中一個可能的原因是由于體內(nèi)外環(huán)境差異造成的。但是，考慮prestin的表達是從底圈開始最后到頂圈，更加合理的解釋應該是：該實驗所表述的第7天是指中圈靠近中底圈的外毛細胞表達prestin，而本實驗病毒轉(zhuǎn)染后的第7天（p7）是指中圈靠近中頂圈的外毛細胞表達了prestin，因此我們認為兩個實驗的結(jié)果是相一致的。

此外，本文實驗組采用一高一低的病毒濃度，并于病毒轉(zhuǎn)染后第9天進行掃描電鏡觀察，我們發(fā)現(xiàn)實驗組腺病毒轉(zhuǎn)染9天后，高濃度轉(zhuǎn)染時，部分再生毛細胞表面靜纖毛由低到高排列，纖毛形態(tài)規(guī)則，形成類V字型結(jié)構，類似于耳蝸毛細胞單個細胞的極性形成；低濃度轉(zhuǎn)染時，再生毛細胞的纖毛未找到規(guī)則的形態(tài)，提示Atoh1過表達的水平越高，異位毛細胞樣細胞表面的纖毛相對越規(guī)則，越易促使新生毛細胞靜纖毛束極性的形成。因此本研究提示，在再生過程中足量的Atoh1過表達水平對于異位毛細胞樣細胞表面形成相對正常的纖毛具有重要作用。

總之，通過本實驗我們發(fā)現(xiàn)通過提高帶有Atoh1基因的腺病毒濃度，可以提高培養(yǎng)組織的Atoh1過表達水平，并且本實驗首次證實了小上皮嵴區(qū)域再生的毛細胞樣細胞出能夠表達prestin，并研究了其與Atoh1過表達水平的關系，我們發(fā)現(xiàn)Atoh1在小上皮嵴的過表達水平越高，誘導生成的異位毛細胞樣細胞數(shù)量越多，表達prestin的新生毛細胞數(shù)量亦越多，當然這些能夠表達prestin的異位毛細胞樣細胞是否具有像外毛細胞一樣的伸縮功能，或其非線性膜電容的特性都值得進一步研究。此外，我們還發(fā)現(xiàn)Atoh1過表達的水平越高，異位毛細胞樣細胞表面的纖毛越相對規(guī)則，單細胞的纖毛極性越易形成?？紤]到毛細胞靜纖毛的極性排列對于毛細胞的機械-電轉(zhuǎn)換功能過程具有重要的意義，因此我們認為Atoh1的過表達水平與新生毛細胞是否具備機械-電轉(zhuǎn)換功能也可能有一定的相關性。